蛋白核心巖藻糖基化在原發(fā)性肝癌中的臨床意義及應(yīng)用研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC），作為肝臟惡性腫瘤的一種，是臨床上原發(fā)性肝癌的主要形式，為世界五大常見惡性腫瘤之一，每年世界范圍內(nèi)近25萬人死于肝癌，在全球腫瘤致死率中高居第三位。中國是肝癌大國，全球50％以上的新發(fā)和死亡肝癌患者發(fā)生在中國。流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究資料表明，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、黃曲霉素、酒精等是我國肝癌發(fā)病的主要病因。研究顯示，大部分肝癌患者都會(huì)經(jīng)歷從肝炎

2、到肝硬化，最后進(jìn)展到肝細(xì)胞癌的過程。目前，肝癌的五年生存率仍不到10％。由于肝癌起病隱匿，發(fā)病時(shí)多數(shù)患者已處于肝癌晚期，失去了治療的機(jī)會(huì)。因此，肝癌的早期診斷尤為重要。目前，組織活檢和病理檢查是肝癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，然而由于其有創(chuàng)性，臨床應(yīng)用有限。血清甲胎蛋白（AFP）自上世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)后逐漸應(yīng)用于臨床，作為迄今為止臨床診斷HCC的首選指標(biāo)，AFP的診斷靈敏度只有約60％，在一些非肝癌疾病如肝臟良性疾病、炎癥反應(yīng)時(shí)也可見其升高，其診斷

3、效果同樣不能讓人滿意。
　　肝癌的起病及進(jìn)展由多個(gè)蛋白分子參與，是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，而研究表明血中過半的蛋白分子都存在糖基化現(xiàn)象。AFP-L3，即核心巖藻糖基化的甲胎蛋白早在2005年就已被美國食品藥品管理局(FDA)采納應(yīng)用于臨床。研究發(fā)生特定糖基化改變的蛋白與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系對于肝病的診治及預(yù)后都具有十分重要的作用。與此同時(shí)，近年來的定量蛋白質(zhì)組學(xué)也取得了巨大的技術(shù)進(jìn)步，以質(zhì)譜為基礎(chǔ)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)越來越多地被應(yīng)用于

4、臨床。本課題將圍繞血清中發(fā)生核心巖藻糖基化改變的蛋白，從兩個(gè)方面探討核心巖藻糖基化蛋白在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的臨床意義。
　　第一部分:凝集素親和富集尋找血清中的原發(fā)性肝癌差異糖蛋白
　　本研究對收集的健康對照(Healthy control，HC)、肝硬化(Liver cirrhosis，LC)及原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)患者的血清差異核心巖藻糖基化蛋白進(jìn)行篩選。LCA可與核心巖

5、藻糖基化聚糖發(fā)生特異性結(jié)合親和富集HC、LC及HCC人群血清蛋白，利用質(zhì)譜技術(shù)尋找三組間差異蛋白。通過先初篩再驗(yàn)證的策略，旨在綜合不同質(zhì)譜技術(shù)差異，篩選核心巖藻糖基化差異蛋白。利用orbitrap質(zhì)譜分析檢測并進(jìn)行三組樣本間差異蛋白分析;隨后擴(kuò)大樣本，采用兩種不同的質(zhì)譜方法對初篩結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并對兩種不同質(zhì)譜方法差異展開分析討論。結(jié)果:綜合初篩及兩種不同質(zhì)譜方法的驗(yàn)證結(jié)果，LC與HC組間的差異蛋白為:血清淀粉樣組分P(Serum amy

6、loid p-component)，孕區(qū)蛋白(Pregnancyzone protein)，觸珠蛋白相關(guān)蛋白(Haptoglobin-related protein)，核心巖藻糖基化的三種蛋白HC組水平顯著高于LC組;HCC與HC組間的差異蛋白為性激素結(jié)合蛋白(Sex hormone binding protein)、多聚免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor)，核心巖藻糖基化的兩種蛋白在HC

7、C組水平顯著高于HC組;HCC與LC組間的差異蛋白包括血清淀粉樣組分P(Serum amyloid p-component)，觸珠蛋白(Haptoglobin)，甲狀腺素運(yùn)載蛋白(Transthyretin)及載脂蛋白L1(Apolipoprotein L1)，四種核心巖藻糖基化蛋白在HCC組水平均顯著高于LC組。結(jié)論:本研究利用糖鏈與凝集素的結(jié)合特性，在親和純化的基礎(chǔ)上，利用高分辨率質(zhì)譜技術(shù)從糖基化層面尋找肝癌、肝硬化的差異蛋白，本實(shí)

8、驗(yàn)得到的差異糖基化蛋白中核心巖藻糖基化的血清淀粉樣組分P、孕區(qū)蛋白、觸珠蛋白相關(guān)蛋白可能具有鑒別診斷HC與LC的潛力;核心巖藻糖基化的性激素結(jié)合蛋白、多聚免疫球蛋白受體或可用于HCC與HC的鑒別診斷;核心巖藻糖基化的血清淀粉樣組分P、觸珠蛋白、甲狀腺素運(yùn)載蛋白及載脂蛋白L1或具有鑒別診斷HCC與LC的潛在價(jià)值。這些發(fā)現(xiàn)均有待后續(xù)研究驗(yàn)證。
　　第二部分:四種特定糖蛋白對HCC診斷及手術(shù)療效判斷意義分析
　　通過閱讀文獻(xiàn)及分析

9、臨床檢測的可及性，本研究對鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)er）、IgG、α2-M及轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin，Trf)這四種特定蛋白及其核心巖藻糖基化組分（以下簡稱為異質(zhì)體）在原發(fā)性細(xì)胞癌中的診斷意義及其在肝細(xì)胞癌根治切除術(shù)前后的隨訪價(jià)值進(jìn)行了初步探討。結(jié)果顯示Fer異質(zhì)體％、α2-M、α2-M異質(zhì)體％及Trf在HCC組與非HCC組間存在差異，其中α2-M、α2-M異質(zhì)體％HCC組水平高于非HCC組。四種特定蛋白與AFP及AFP-L

10、3％相關(guān)性比較中，IgG異質(zhì)體％、Trf異質(zhì)體％均與AFP-L3％呈正相關(guān)。四種特定蛋白及其異質(zhì)體％對HCC的診斷陽性率均不及目前臨床廣泛應(yīng)用的AFP及AFP-L3％;四種特定蛋白中，只有α2-M及其異質(zhì)體％對HCC診斷的AUC＞0.6(p＜0.05)。聯(lián)合檢測AFP、α2-M及α2-M異質(zhì)體％可顯著提高對HCC的診斷價(jià)值，尤其是診斷靈敏度從單獨(dú)檢測AFP時(shí)的不足85％提升到90％。對四種特定蛋白與HCC腫瘤大小的相關(guān)研究顯示，HCC腫

11、瘤直徑與Trf-L3％正相關(guān)。在30例行肝癌根治性切除術(shù)的標(biāo)本中，F(xiàn)er異質(zhì)體、Fer異質(zhì)體％、IgG、IgG異質(zhì)體、Trf異質(zhì)體在術(shù)前術(shù)后有顯著性差異，其中Fer異質(zhì)體、Fer異質(zhì)體％術(shù)后水平較術(shù)前降低。在HCC根治性切除術(shù)前術(shù)后AFP顯著下降組中，術(shù)后較術(shù)前顯著降低的指標(biāo)有Fer異質(zhì)體、Fer異質(zhì)體％及IgG異質(zhì)體％;在術(shù)前AFP陰性的術(shù)前術(shù)后配對標(biāo)本中，α2-M異質(zhì)體及α2-M異質(zhì)體％水平在術(shù)后較術(shù)前顯著降低。結(jié)論:四科臨床常用的