LPS聯(lián)合恩諾沙星致雞肝細(xì)胞損傷模型的建立及復(fù)方甘草酸單胺保護(hù)機(jī)理研究.pdf

1、家禽細(xì)菌感染性疾病防治過程中常需使用抗菌藥物，而殺菌型抗菌藥往往誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌釋放內(nèi)毒素。內(nèi)毒素、抗菌藥物皆可誘發(fā)肝損傷，二者共同刺激致肝損傷的病理演變規(guī)律及藥物修復(fù)機(jī)理亟待探明。本文在內(nèi)毒素、恩諾沙星單獨(dú)誘發(fā)雞肝細(xì)胞損傷基礎(chǔ)上，建立內(nèi)毒素與恩諾沙星聯(lián)合誘發(fā)新型復(fù)合式肝細(xì)胞損傷模型，并藉此研究其病理發(fā)生發(fā)展及復(fù)方甘草酸單胺的保護(hù)作用及機(jī)理。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、雞肝細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)方法的建立
　　采用半原位兩

2、步灌流法，對40-50日齡的海藍(lán)公雞進(jìn)行肝細(xì)胞分離，臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)算肝細(xì)胞存活率和細(xì)胞總數(shù)。肝細(xì)胞以5×105 cell/ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3ml，含10％胎牛血清Williams'mediumE培養(yǎng)基中，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)，測定不同培養(yǎng)階段細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活力。結(jié)果顯示，肝細(xì)胞存活率≥95％，肝細(xì)胞產(chǎn)量為（4.1±0.2）×108cell/肝;培養(yǎng)48 h至144h，細(xì)胞上清液中LDH活力在

3、低水平下保持穩(wěn)定，細(xì)胞可維持良好的生長狀態(tài)達(dá)7天以上。
　　2、LPS聯(lián)合恩諾沙星誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞損傷體外模型的建立
　　2.1 LPS、恩諾沙星致肝細(xì)胞損傷劑量的篩選取上述分離培養(yǎng)48h肝細(xì)胞，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。LPS組分別用濃度為0（對照）、10、20、30、40、50、60、80、100μg/ml的LPS損傷肝細(xì)胞(n=3);恩諾沙星組分別用濃度為0（對照）、100、120、140、160、180、200、220、240μg/

4、ml的恩諾沙星損傷肝細(xì)胞(n=3)。24h后，檢測肝細(xì)胞存活率，上清液ALT、AST活性，篩選致肝細(xì)胞損傷的較佳劑量。結(jié)果顯示:與對照組相比，隨LPS、恩諾沙星濃度增加，肝細(xì)胞存活率與ALT、AST呈劑量依賴性下降和上升。其中，10、20、30、40、50μg/ml的LPS組肝損傷不明顯，60、80、100μg/mlLPS組肝細(xì)胞存活率極顯著降低(p＜0.01)，ALT、AST活性極顯著升高(p＜0.01);100、120、140、16

5、0μg/ml的恩諾沙星對肝細(xì)胞損傷不明顯，而180、200、220、240μg/ml恩諾沙星肝細(xì)胞存活率極顯著降低(p＜0.01)，ALT、AST活性極顯著升高(p＜0.01)。故確定LPS劑量60μg/ml、恩諾沙星劑量180μg/ml為各自致肝細(xì)胞損傷最佳劑量。
　　2.2 LPS聯(lián)合恩諾沙星致雞肝細(xì)胞體外損傷模型的建立在2.1基礎(chǔ)上，取正常培養(yǎng)48h的肝細(xì)胞，進(jìn)行LPS聯(lián)合恩諾沙星致肝細(xì)胞損傷相互影響的研究。用含0（對照）、

6、30+40、30+60、30+80、30+100、30+120μg/mlLPS+恩諾沙星的生長培養(yǎng)液換液(n=3)，培養(yǎng)24h后，檢測肝細(xì)胞存活率，上清液ALT、AST活性。結(jié)果顯示:與對照組相比，隨LPS中添加的恩諾沙星劑量的增加，肝細(xì)胞損傷程度相應(yīng)加大。其中30μg/mlLPS+80μg/ml恩諾沙星使肝細(xì)胞存活率下降50％，ALT、AST活性極顯著升高(P＜0.01)，故確定該組合濃度作為新型復(fù)合式肝細(xì)胞損傷最佳造模劑量。

7、　　3、復(fù)方甘草酸單胺對LPS聯(lián)合恩諾沙星致肝細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)理研究
　　取培養(yǎng)48h肝細(xì)胞，對照組:生長培養(yǎng)液換液(n=3)。模型組:含30+80μg/ml LPS+恩諾沙星的生長培養(yǎng)液換液(n=3);治療組:以30+80μg/ml LPS+恩諾沙星致肝細(xì)胞損傷24h后，用含CAG濃度為25、50、100、200、400μg/ml的生長培養(yǎng)液換液(n=3)。各組換液處理后均繼續(xù)培養(yǎng)24h，進(jìn)行以下試驗(yàn):
　　3.1復(fù)方甘草

8、酸單胺對肝細(xì)胞保護(hù)和抗氧化作用檢測肝細(xì)胞培養(yǎng)上清液和勻漿液中ALT、AST、SOD、GSH、MDA等生化指標(biāo)的含量及肝細(xì)胞存活率來研究復(fù)方甘草酸單胺對LPS聯(lián)合恩諾沙星誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)和抗氧化作用。結(jié)果顯示:復(fù)方甘草酸單胺可抑制LPS聯(lián)合恩諾沙星損傷引起的ALT、AST活性和MDA含量的升高(p＜0.05)，顯著提高SOD、GSH及肝細(xì)胞存活率(p＜0.05)。該結(jié)果表明:復(fù)方甘草酸單胺對雞肝細(xì)胞有保護(hù)作用，該保護(hù)作用可能與其抗氧

9、化，清除自由基能力有關(guān)。
　　3.2復(fù)方甘草酸單胺對肝細(xì)胞凋亡損傷的影響流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞早期凋亡比率，熒光定量PCR檢測Caspase-3，Bax，Bcl-2，F(xiàn)as mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:復(fù)方甘草酸單胺可顯著抑制由LPS聯(lián)合恩諾沙星損傷引起的細(xì)胞早期凋亡比率增加;與對照組比較，模型組細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，Caspase-3，Bax，F(xiàn)as mRNA表達(dá)顯著升高。復(fù)方甘草酸單胺可一定程度上減輕Bcl-2 mR