玉米行粒數(shù)主效QTL KERNEL NUMBER PER ROW6(KNR6)的克隆與功能解析.pdf

1、玉米是世界上最重要的糧食作物之一，為了滿足人們對玉米及其衍生產(chǎn)品飼料和能源的需求，提高玉米產(chǎn)量是必需的。在過去的一個多世紀里，育種家致力于提高玉米雜交種產(chǎn)量，在玉米大果穗和適應性強的品種選育上取得了巨大成功。但是產(chǎn)量是由微效多基因控制的復雜性狀，至今我們對玉米產(chǎn)量形成的遺傳基礎(chǔ)以及玉米改良過程中所選擇的位點信息知之甚少。行粒數(shù)和穗長是玉米重要的產(chǎn)量性狀。本研究通過精細定位，候選基因關(guān)聯(lián)分析，表達量分析及玉米遺傳轉(zhuǎn)化驗證，鑒定克隆到一個控

2、制行粒數(shù)和穗長的QTL KERNEL NUMBER PER ROW6(KNR6)，編碼絲氨酸蘇氨酸類受體蛋白激酶，主要研究結(jié)果如下:
　　1.KNR6的精細定位與分離
　　利用NILqKNR6（長穗）與其近等基因系NILqknr6（短穗）回交，構(gòu)建分離群體。在超過28000個單株的回交群體中共鑒定了10種不同交換類型的重組基因型。通過重組單株的子代測驗，將qKNR6定位在標記M6-M8約110kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間編碼2個基因

3、，Zm00001d036601和Zm00001d036602?；赑CR擴增重測序和表達量分析發(fā)現(xiàn)，Zm00001d036601在近等基因系中無序列差異和表達差異，Zm00001d036602作為KNR6的候選基因，在近等基因系中存在4個多態(tài)性位點，包括5'-UTR區(qū)域一個5054bp轉(zhuǎn)座子插入缺失的變異，及外顯子上3個SNP變異，其中兩個SNP為非同義替換。相對于NILqknr6等位基因型，第一外顯子上堿基C/T的替換，導致第7位的氨

4、基酸由亮氨酸變成了苯丙氨酸，第三外顯子上堿基C/T的替換，導致第70位氨基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變成了纈氨酸，第三外顯子219位堿基G/A為同義替換。KNR6的5'-UTR區(qū)域在NILqknr6中存在一個5054bp轉(zhuǎn)座子插入。進一步分析5054bp的轉(zhuǎn)座子序列，它包含3bp TTA堿基正向重復和14bp的反向重復序列，是在一個MITE轉(zhuǎn)座子上插入了4926bp序列而形成的一個新的Harbinger-like轉(zhuǎn)座子。
　　2.近等基因系中K

5、NR6甲基化水平與基因表達量
　　Harbinger-like轉(zhuǎn)座子的插入，導致KNR6核心啟動子區(qū)CG、CHG及CHH類型的甲基化水平顯著提高，且TE下游緊鄰區(qū)域的CG的甲基化水平也顯著提高，甲基化水平提高抑制KNR6在NILqknr6中的轉(zhuǎn)錄水平。105個玉米自交系和12個近等基因系幼穗表達量分析結(jié)果證實，KNR6的表達量與行粒數(shù)，穗長極顯著正相關(guān)。KNR6在20個TE+(KNR6上存在Harbinger-like轉(zhuǎn)座子插入)

6、自交系材料平均表達量顯著低于85個TE（KNR6上不存在Harbinger-like轉(zhuǎn)座子插入）自交系材料。
　　3.KNR6功能分析
　　以玉米自交系A(chǔ)188為轉(zhuǎn)化受體，獲得了2個獨立的RNAi轉(zhuǎn)化事件，2個超表達轉(zhuǎn)化事件。表型鑒定結(jié)果表明，相對于陰性對照植株，RNAi轉(zhuǎn)化家系中，陽性植株穗長平均縮短1.35±0.11cm(p=2.05×10-14)，行粒數(shù)平均降低2.85±0.22粒(p=1.37×10-25)，花期平均

7、提前2.3±0.11d(p=1.32×10-9)。KNR6超表達家系中，陽性植株穗長平均增加1.1±0.26cm(p=3.53×10-15)，每行粒數(shù)增加2.5±0.15粒(p=1.85×10-28)，花期推遲3.1±0.35d(p=2.42×10-21)。
　　4.KNR6的關(guān)聯(lián)分析
　　在224個不同的自交系材料中，KNR6共存在93個最小等位基因頻率大于0.05的多態(tài)性位點，其中有56個位點與行粒數(shù)，穗長變異顯著關(guān)聯(lián)，

8、包括編碼區(qū)的一個非同義突變(L7F，p=3.62×10-4)。與TE-PAV(Harbinger-like轉(zhuǎn)座子存在缺失的變異)在一個連鎖不平衡區(qū)域(r2≥0.97)的50個變異位點與行粒數(shù)相關(guān)性最強(p=8.81×10-5)。
　　5.KNR6等位基因在的育種應用價值上的評價
　　利用NILqknr6和NILqKNR6分別與11個TE+自交系和10個TE自交系雜交，構(gòu)建42個雜交組合。在不同的自交系遺傳背景下，與NILqK

9、NR6雜交獲得的F1雜交種的穗長較長，行粒數(shù)較多，表明KNR6可以用于雜交種穗長和行粒數(shù)的遺傳改良，進而提高雜交種的籽粒產(chǎn)量。進一步地利用KNR6TE-等位基因?qū)︵崋?58的兩個親本（鄭58和昌7-2）進行MAS改良，改良后的鄭58和昌7-2在穗長和行粒數(shù)上都有所增加，且生育期不同程度的推遲。小區(qū)測產(chǎn)數(shù)據(jù)表明，Zheng58qKNR6×Chang7-2qKNR6的籽粒產(chǎn)量為13.3T/ha，顯著高于Zheng58×Chang7-2的12

10、.6T/ha(p=4.12×10-5)，產(chǎn)量提高約5.6％，這些結(jié)果說明KNR6可以用來提高雜交種的行粒數(shù)，進而提高雜交種的籽粒產(chǎn)量。
　　6.KNR6TE+位基因的起源與KNR6馴化選擇分析
　　對43個大芻草材料，275個玉米自交系（包括214個溫帶材料，61個熱帶材料），24個地方品種材料進行重測序。通過核苷酸多樣性分析，KNR6的5'-UTR內(nèi)含子區(qū)域(TE-PAV)在馴化中受到了強烈的選擇。地方品種中的Harbin

11、ger-like轉(zhuǎn)座子起源于玉米祖先種大芻草的MITE，MITE在馴化過程中插入了一個大的片段序列形成一個新的DNA轉(zhuǎn)座子，進而傳遞到玉米自交系中并在溫帶玉米材料中得以富集。
　　總之，KNR6調(diào)控行粒數(shù)，穗長和生育期。該基因編碼絲氨酸蘇氨酸類受體蛋白激酶。位于KNR65'-UTR非翻譯區(qū)的Harbinger-like轉(zhuǎn)座子存在缺失的變異是KNR6功能變異的重要位點。它顯著影響玉米的產(chǎn)量并對生育期有相對較弱的影響，Harbinge