玉米GRF--interacting Factor1(gif1)突變基因的圖位克隆及生物學(xué)功能解析.pdf

1、植物的形態(tài)建成是由細(xì)胞的不確定性與細(xì)胞命運的決定性之間的平衡來決定。分生組織和有多向分化功能的干細(xì)胞都具有不確定性，是側(cè)生器官產(chǎn)生的基礎(chǔ)。本研究鑒定到一個分生組織確定性與不確定性平衡上存在缺陷的玉米突變體，在葉片和莖細(xì)胞中不確定性細(xì)胞減少，突變體的花序分生組織頂端扁化，失去對側(cè)生分生組織不確定性的控制。通過圖位克隆的方法確定一個生長調(diào)節(jié)共轉(zhuǎn)錄激活因子GROWTH REGULATING FACTOR-INTERACTING FACTOR1

2、（GIF1），是引起突變體表型變化的基因。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.突變體gif1植株及細(xì)胞學(xué)表型變異
　　與野生型相比，突變體gif1植株矮化且葉片窄;雄穗長分支數(shù)目減少但雌穗基部有額外的分支發(fā)生且頂端呈現(xiàn)扁平化現(xiàn)象;突變體表現(xiàn)雌雄敗育，與其它自交系正反交均不能結(jié)實，通過雜合基因型植株自交獲得突變體。細(xì)胞學(xué)研究表明突變體gif1雌雄花序分生組織頂端扁平化且不確定性異常，突變體雄穗分支數(shù)減少且分生組織發(fā)育滯后，雌穗的分

3、支數(shù)增加;雄花序小花分生組織中穎片原基發(fā)育受到抑制，雌花序的下位花和雄蕊原基的退化進(jìn)程相對滯后。
　　2.圖位克隆鑒定突變基因為ZmGIF1
　　遺傳分析表明該突變體表型受一對隱性單基因控制。圖位克隆結(jié)果顯示候選基因位于玉米第1號染色體的長臂，編碼一個GIF1的轉(zhuǎn)錄因子（GRMZM2G180246，是擬南芥AtGIF1/ANGUSTIFOLIA3（AN3）和水稻OsGIF1的同源基因。對GRMZM2G180246基因進(jìn)行重測

4、序分析發(fā)現(xiàn)，野生型和gif1突變體中植株該基因存在顯著差異，其中第3外顯子上一個51bp的序列插入是主要的變異位點，包括一個43bp的Popin轉(zhuǎn)座子和一個8bp的正向重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座子插入到蛋白結(jié)構(gòu)域中，引起轉(zhuǎn)錄終止，是導(dǎo)致該基因的轉(zhuǎn)錄效率顯著降低的直接原因。
　　gif1-mum1轉(zhuǎn)座子Mu7插入到GIF1基因的5'端非編碼區(qū)(5'-UTR)的突變體，通過gif1-mum1表達(dá)分析及單株及與W22的回交后代群體表型的鑒定，證明G

5、IF1是所克隆到的基因。GIF1基因組全長3656bp，CDS全長686bp，編碼227個氨基酸;GIF1屬于GIFs家族，是共轉(zhuǎn)錄激活因子，編碼高度保守的SNH結(jié)構(gòu)域蛋白和GRFs-N端保守結(jié)構(gòu)域QLQ特異識別，形成不同形式的互作復(fù)合物。
　　3.GIF1基因的特異性表達(dá)
　　GIF1在分生能力較強的組織中表達(dá)量較高，主要包括莖頂端分生組織和幼嫩的雌雄穗分生組織;GIFs和GRFs的表達(dá)模式分析表明，ZmGIF1在花序發(fā)育

6、中具有明顯的特異性，且在花序發(fā)育早期高于晚期;GRFs的表達(dá)在不同組織間存在一定的差異。原位雜交表明GIF1在SAM中除了頂端部位外不僅在幼嫩的葉原基中強烈表達(dá)，而且在SAM的基部即未來發(fā)育為節(jié)間的部位表達(dá);gif1突變體中，SAM和葉片無表達(dá)。在花序分生組織中，GIF1在除去頂點的IM中及在SPM和SM都是高水平表達(dá)的，而且在花序分生組織周圍尤其是內(nèi)外稃原基中特異富集，突變體中未檢測到表達(dá)。另外，GIF1在SM及SPM分生組織中的表達(dá)

7、方式與ramosa2(ra2)有重疊，同時ra2在突變體中的表達(dá)顯著減少，說明二者可能在功能上存在部分重疊。
　　4.GIF1基因的調(diào)控與互作
　　利用未成熟雄穗RNA-seq分析共鑒定出1468個差異表達(dá)基因(DEGs)(q＜0.05)，其中在突變體gif1中上調(diào)的基因有350個，1118個為下調(diào)基因。GO聚類分析表明差異表達(dá)基因主要集中于生物過程及分子功能等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)途徑。在gif1中，幾個重要的花序發(fā)育相關(guān)基因ub3

8、、ra2、te1、zfl1/2、vt2等顯著下調(diào)，它們是腋生分生組織身份決定性和確定性（identity and determinacy）的重要調(diào)節(jié)因子，與細(xì)胞周期、生長素合成及響應(yīng)相關(guān)的基因在gif1中顯著下調(diào)。GRFs中GRF3上調(diào)，GRF7和GRF17顯著下調(diào)，GIF2和GIF3的表達(dá)未受影響。
　　染色質(zhì)免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)GIF1以32.4％的比例結(jié)合在基因區(qū)，以12.0％結(jié)合在轉(zhuǎn)錄起始位點TSS上游的1.0kb的啟動子區(qū)

9、;peak附近10Kb以內(nèi)共檢測到1275個GIF1可能的靶基因，包括一些已知的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。通過ChIP-seq與RNA-seq數(shù)據(jù)比較分析共發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在gif1突變體中有50個基因與GIF1直接結(jié)合，37個基因表現(xiàn)下調(diào)，13個基因上調(diào)。
　　GIF1蛋白與16個GRFs中除了GRF7、GRF11和GRF20外的13個蛋白互作，GIF1能夠在轉(zhuǎn)錄水平上自我調(diào)節(jié)豐度，并通過直接結(jié)合UB3影響玉米雄穗的分支發(fā)育。
　　5

10、.候選基因的關(guān)聯(lián)位點
　　通過對具有豐富的自然變異且來源于不同亞群的玉米自交系進(jìn)行重測序，檢測到最小等位基因頻率(MAF)大于0.05的多態(tài)性位點22個，其中5個位點與植株和花序發(fā)育顯著相關(guān)。主要集中在轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.0Kb左右的位置和5'-UTR區(qū)，說明該基因的遺傳變異主要分布在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，GIF1可能是在表達(dá)水平的調(diào)控，而不是功能上出現(xiàn)變異;表型數(shù)據(jù)與GIF1的遺傳變異進(jìn)行候選基因關(guān)聯(lián)分析，位于exon1的A/G和int