奧拉西坦對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響及對(duì)PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用.pdf

1、血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment, VCI)是由各種腦血管疾病引起的以學(xué)習(xí)、記憶功能障礙為主要癥狀的獲得性智能損害綜合征，其病程發(fā)展的晚期階段被稱(chēng)作血管性癡呆（vascular dementia，VD）。目前，VD已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)繼阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease， AD)之后的第二大癡呆類(lèi)型。但是，迄今為止，VD的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，因而缺乏有效的治療藥物。研究表明

2、，慢性腦低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）損傷在VD的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，因此探討慢性腦低灌注損傷導(dǎo)致VD的發(fā)病機(jī)制，并尋求有效的癡呆防治藥物成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。
　　已有的研究表明，神經(jīng)元的自噬與凋亡在慢性腦低灌注損傷導(dǎo)致VD的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，因此調(diào)控神經(jīng)元的自噬與凋亡對(duì)于減緩神經(jīng)元損傷至關(guān)重要。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（ phosphoinositid

3、e-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路是一條經(jīng)典的抗凋亡、促存活通路，該通路的激活在缺血缺氧性神經(jīng)元損傷中起著重要作用。近年來(lái)的研究表明，PI3K/Akt通路及其相關(guān)下游信號(hào)因子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的激活對(duì)于神經(jīng)元自噬具有調(diào)節(jié)作用。
　　奧拉西坦(oxiracetam， ORC)是一種新型的吡咯烷酮類(lèi)促智藥（ n

4、ootropic drugs），化學(xué)名為4-羥基-2-酮-1-吡咯烷乙酰胺（4-hydroxy-2-oxo-1-pyrrolidineacetamide）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ORC可以透過(guò)血腦屏障，能選擇性地作用于海馬、皮層和紋狀體，提高大腦對(duì)血氧及葡萄糖的利用能力，激活、保護(hù)或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的功能恢復(fù)。ORC藥物本身無(wú)直接的血管活性，也沒(méi)有中樞興奮作用，但可以通過(guò)增強(qiáng)蛋白激酶C（protein kinases C，PKC）的活性、促進(jìn)突觸可

5、塑性、促進(jìn)大腦長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long? term potentiation，LTP）的產(chǎn)生等多種途徑，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶功能的改善發(fā)揮持久的促進(jìn)作用。但是，ORC對(duì)慢性腦缺血致癡呆大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用尚不十分清楚。
　　基于上述研究背景，本研究通過(guò)雙側(cè)頸動(dòng)脈永久結(jié)扎法（ bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）建立大鼠慢性腦低灌注致VD模型，觀察并探討（1）BCCAO術(shù)后大鼠認(rèn)知功能及

6、海馬組織形態(tài)變化，（2）進(jìn)一步觀察不同給藥時(shí)間及給藥劑量下ORC的神經(jīng)保護(hù)作用，該神經(jīng)保護(hù)作用是否與激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)？（3）觀察ORC對(duì)海馬神經(jīng)元自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為探討ORC改善認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。
　　第一部分血管性癡呆大鼠模型的建立及奧拉西坦對(duì)血管性癡呆大鼠認(rèn)知功能的影響
　　目的：通過(guò)BCCAO方法建立大鼠慢性腦低灌注致VD模型，并觀察ORC對(duì)術(shù)后4周及8周大鼠空

7、間學(xué)習(xí)、記憶功能的影響。
　　方法：3月齡清潔級(jí)健康雄性 SD(Sprague-Dawley)大鼠，體重250-300g，隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組（sham組），模型組（vehicle組）， ORC低劑量組（ORC-L），ORC高劑量組（ORC-H）。每組于術(shù)后4周、8周進(jìn)行觀察（每亞組10只）。
　　采用BCCAO法制備VD大鼠模型，BCCAO術(shù)后次日開(kāi)始進(jìn)行藥物干預(yù)。低劑量及高劑量治療組分別給予100mg/kg和200mg

8、/kg ORC灌胃，每日一次，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。最后一次給藥的次日，應(yīng)用Morris水迷宮自動(dòng)記錄儀對(duì)所有存活小鼠進(jìn)行為期6天的行為學(xué)測(cè)試。
　　結(jié)果：BCCAO術(shù)后4周，總的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，訓(xùn)練天數(shù)(F=166.03， P＜0.01)、組間比較(F=51.132，P＜0.01)以及訓(xùn)練天數(shù)和組別的交互作用(F=3.515，P＜0.01)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組相比，從第2天開(kāi)始， ORC低劑量治療組大鼠的逃

9、避潛伏期縮短，在第3天和第5天差異最為顯著（P<0.05），而ORC高劑量治療組逃避潛伏期的縮短在第3天至第5天均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（第3天P<0.05，第4、5天P<0.01）。在訓(xùn)練的5天內(nèi)，ORC高劑量治療組比低劑量治療組的逃避潛伏期均有縮短，尤其在第4天和第5天兩組之間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　BCCAO術(shù)后8周，總的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，訓(xùn)練天數(shù)(F=119.222，P＜0.01)、組間比較(F=13.376，

10、 P＜0.01)以及訓(xùn)練天數(shù)和組別的交互作用(F=2.011，P＜0.05)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與假手術(shù)組相比，在訓(xùn)練的5天內(nèi)模型組大鼠的逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（第1天P<0.01，第2天P<0.05，第3至5天P<0.01），提示本實(shí)驗(yàn)造模方法持續(xù)有效。與模型組相比，從第2天開(kāi)始，ORC低劑量治療組大鼠的逃避潛伏期縮短，在第4天（P<0.05）和第5天差異最為顯著（P<0.01），而ORC高劑量治療組逃避潛伏期的縮短在第

11、3天至第5天均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在訓(xùn)練的5天內(nèi)，ORC高劑量治療組比低劑量治療組的逃避潛伏期均有縮短，但是僅在訓(xùn)練第3天時(shí)兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　　空間探索實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組相比，VD模型組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比顯著下降（P<0.01）；與模型組相比，低劑量及高劑量治療組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比均有增加（P<0.01）。在術(shù)后4周和8周整個(gè)觀察期間，這種趨勢(shì)持續(xù)存在，但以術(shù)后8周高

12、劑量治療組的效果最為明顯。
　　結(jié)論：雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎形成慢性腦低灌注制備VD大鼠模型，在一定程度上與臨床VD的發(fā)病過(guò)程相似，是VD的理想動(dòng)物模型。奧拉西坦可有效改善VD大鼠的認(rèn)知功能。奧拉西坦連續(xù)應(yīng)用8周改善認(rèn)知的效果優(yōu)于連續(xù)應(yīng)用4周。
　　第二部分奧拉西坦不同劑量和不同給藥時(shí)間對(duì)血管性癡呆大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)的影響
　　目的：觀察BCCAO術(shù)后大鼠行為學(xué)的改變及海馬組織形態(tài)學(xué)變化。
　　方法：行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，

13、HE染色觀察各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠海馬錐體細(xì)胞數(shù)量較多，無(wú)明顯的神經(jīng)元丟失現(xiàn)象，細(xì)胞排列整齊、致密，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，胞漿清亮，胞核大而圓，核仁清晰。相比之下，VD模型組大鼠術(shù)后4周、8周海馬錐體細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元丟失較明顯，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)呈嗜酸性，胞核固縮深染，核仁消失。術(shù)后4周模型組損傷最明顯，部分區(qū)域僅見(jiàn)少量神經(jīng)元存活。在ORC低劑量及高劑量治療組中，神經(jīng)

14、元丟失減少，仍可見(jiàn)少量核固縮。尤其在8周高劑量治療組中改善明顯。
　　結(jié)論：慢性腦低灌注損傷在引起大鼠學(xué)習(xí)、記憶障礙的同時(shí)，還可導(dǎo)致海馬組織神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)變化，以BCCAO術(shù)后4周模型組損傷最為顯著。經(jīng)過(guò)奧拉西坦干預(yù)后，治療組大鼠認(rèn)知功能改善的同時(shí)，海馬神經(jīng)元的損傷也得到一定程度的減輕，高劑量組效果優(yōu)于低劑量治療組。
　　第三部分奧拉西坦對(duì)血管性癡呆大鼠PI3K/Akt通路的影響
　　目的：觀察觀察血管性癡

15、呆大鼠海馬組織中 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達(dá)水平的變化及ORC的干預(yù)作用。
　　方法：造模4周及8周后應(yīng)用Western-Blot方法測(cè)定各組大鼠海馬組織中Akt、p-Akt Ser473、mTOR和p-mTOR Ser2448蛋白的動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果：BCCAO術(shù)后4周各組之間 Akt總蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）；與假手術(shù)組相比，模型組、ORC低劑量組和高劑量組p-Akt Ser473蛋白表達(dá)

16、明顯增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組相比，ORC低劑量組和高劑量組p-Akt Ser473的表達(dá)明顯增強(qiáng)。BCCAO術(shù)后4周各組之間mTOR總蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（P>0.05）與假手術(shù)組相比，模型組、ORC低劑量組和高劑量組p-mTOR Ser2448蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.01）；與模型組相比，ORC低劑量組和高劑量組 p-mTOR Ser2448的表達(dá)明顯增強(qiáng)。BCCAO術(shù)后8周各組之間Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的蛋

17、白表達(dá)在各組之間的變化趨勢(shì)與4周組相同。
　　結(jié)論：慢性腦低灌注損傷導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷，應(yīng)用ORC干預(yù)后海馬神經(jīng)元損傷減輕，大鼠認(rèn)知功能得到改善，該作用可能是通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　第四部分奧拉西坦對(duì)血管性癡呆大鼠海馬組織凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　目的：觀察血管性癡呆大鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值以及自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比值、Beclin1、p62蛋白表達(dá)水平

18、的變化，進(jìn)一步觀察ORC對(duì)神經(jīng)元凋亡及自噬的干預(yù)作用。
　　方法：造模4周及8周后應(yīng)用Western-Blot方法測(cè)定各組大鼠海馬組織中Bcl-2、Bax、LC3、Beclin1、p62蛋白的動(dòng)態(tài)變化。
　　結(jié)果：與假手術(shù)組相比，術(shù)后4周模型組大鼠海馬組織Bcl-2/Bax比值下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，奧拉西坦治療組Bcl-2/Bax比值升高，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。低劑量與高劑量組之間比

19、較，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與假手術(shù)組相比，BCCAO術(shù)后4周模型組大鼠海馬組織LC3-II/I比值升高，Beclin1蛋白表達(dá)水平明顯增加，p62蛋白表達(dá)顯著下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01， P＜0.01）。與模型組相比，奧拉西坦治療組大鼠LC3-II/I比值下降，p62蛋白表達(dá)顯著增加，高劑量治療組大鼠較低劑量治療組大鼠變化更明顯（P＜0.05）；Beclin1蛋白表達(dá)有所減少，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞