贛南地區(qū)柑橘衰退病毒遺傳多樣性及基因型分析.pdf

1、衰退病是柑橘上最具毀滅性的病毒性病害之一，已導(dǎo)致全世界多個柑橘主產(chǎn)區(qū)的柑橘樹死亡。柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）主要通過感病接穗嫁接和蚜蟲取食進(jìn)行傳播，全基因組包含12個開放閱讀框，其中ORF6編碼的外殼蛋白覆蓋了病毒粒子約95％的全基因組，其與CTV致病力相關(guān)且是病毒裝配過程中所必須的。CTV還存在明顯的株系分化，并可分為多種基因型。根據(jù)CTV在寄主上表現(xiàn)不同感病癥狀可分為苗黃型、莖陷點(diǎn)型、速衰型三

2、種分離株類型；根據(jù)CTV全基因組序列差異還可將CTV劃分為七種基因型。本研究調(diào)查了贛南柑橘果園的衰退病發(fā)病情況；通過RT-PCR技術(shù)對感染CTV的樣品擴(kuò)增目的片段并克隆測序，進(jìn)行遺傳多樣性分析；利用兩類基因型鑒定引物分析樣品的基因型，并對部分樣品進(jìn)行片段克隆測序和序列分析遺傳，明確贛南地區(qū)CTV分離株的遺傳多樣性和基因型組成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1、在江西贛南15個縣（市、區(qū)）的柑橘果園以隨機(jī)采樣的方式，收集了351份品種均為紐荷

3、爾的柑橘樣本，抽提樣本總RNA進(jìn)行CTV的CP（Coat protein, CP）基因RT-PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)顯示，有175份樣品感染CTV，單個采樣點(diǎn)的感染率在39.3%～69.3%，平均感病率在49.85%，結(jié)果表明柑橘衰退病在贛南地區(qū)的柑橘果園普遍發(fā)生。
　　2、隨機(jī)選取78份陽性樣本擴(kuò)增CTV的CP基因并克隆測序，分析序列基因重組和堿基含量，并將所測序列與10個致病性不同的國外CTV分離株進(jìn)行核苷酸遺傳距離、序列同源

4、性和系統(tǒng)進(jìn)化分析。分析可知：采自江口編號為JK4的樣品在35～490nt區(qū)域之間存在基因重組，該重組事件被5種運(yùn)算法則檢測到，P值在3.746×10-4～1.811×10-2之間；78份樣品的平均GC含量為52.8%，AT（U）含量為47.2%，平均堿基含量GC＞AT；78份樣品CP基因核苷酸遺傳距離在0.000～0.072，與10個國外CTV分離株遺傳距離在0.005～0.106；樣品的CP基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為94.7%

5、～100%，92.3%～100%，與10個國外CTV分離株的分別為76.5%～84.1%，73.6%～80.3%；系統(tǒng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，多個采自同一地點(diǎn)的樣品在聚類樹上分處于不同組群且分支遠(yuǎn)近不同，部分樣品與國外莖陷點(diǎn)型和衰退型CTV分離株聚為一支，它們序列相似性相對較高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明贛南地區(qū)CTV分離株CP基因保守性較高，序列存在一定程度的變異，各采樣點(diǎn)的CTV分離株之間親緣性較高但與國外CTV分離株之間親緣性相對偏低，大部分贛南地區(qū)的樣

6、品可能存在混合侵染現(xiàn)象。
　　3、分別利用Hilf、Roy設(shè)計(jì)的引物鑒定135份樣品的基因型。Roy的引物鑒定顯示：有43份樣品為單基因型，基因型分別為VT、T3、B165，均由強(qiáng)毒型分離株組成；41份樣品的基因型混合了兩種分離株，其中有5份由強(qiáng)弱毒分離株混合，36份由強(qiáng)毒分離株混合；基因型包含三種分離株的樣品中，有4份基因型為VT+T3+T36，剩余4份基因型混合了強(qiáng)弱毒分離株；基因型混合四種分離株的樣品有8份，其中2份為VT+

7、T3+T36+B165組合，6份為VT+T3+T30+T36組合；還有35份樣品無法判斷基因型。Hilf的引物鑒定顯示：有44份樣品為單基因型，也均由強(qiáng)毒型分離株組成，其中最多的是VT基因型，其次為T36基因型，T3基因型較少；有35份樣品的基因型包含了兩種分離株，基因型均由強(qiáng)毒型分離株組成的有兩種：VT+T36和VT+T3，這兩種基因型樣品有25份，剩余10份樣品基因型混合了強(qiáng)弱毒分離株；8份樣品的基因型包含三種分離株，其中有4份為V

8、T+T3+T36組合，3份為VT+T30+T3組合，T3+T30+T36組合的樣品僅1份；有一份樣品的基因型包含了4種分離株；還有47份樣品無法鑒定基因型。結(jié)合兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：贛南地區(qū)存在VT、T3、T30、T36和B165五種基因型；其中大部分樣品基因型包含多種分離株，基因型組合復(fù)雜多樣；VT分離株在樣品的基因型中出現(xiàn)的頻率最高，基因型組合為VT+T3、VT+T36的樣品較多；部分樣品利用兩類引物鑒定基因型結(jié)果不一致，還有部分樣品利

9、用兩類引物均無法鑒定基因型。
　　4、分別選取了9份用兩類引物鑒定結(jié)果相同和不同的樣品，利用Hilf的引物擴(kuò)增樣品的目的片段并克隆測序，分析其遺傳信息。結(jié)果表明：5’、k17序列發(fā)育樹中，與參考分離株聚為一支或一組的樣品通過兩類引物鑒定均顯示基因型包含相應(yīng)的參考分離株，它們之間序列相似性較高，遺傳距離也較近；多份樣品通過兩類引物鑒定基因型均顯示包含某種分離株但并沒有與相應(yīng)的參考分離株聚為一組，它們之間序列相似性較低，遺傳距離也較遠(yuǎn)