中藥復(fù)雜體系中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的HPLC-MS分析及半枝蓮中黃酮類成分的藥代動力學(xué)研究.pdf

1、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)集HPLC的高效分離能力和MS的高靈敏度、強結(jié)構(gòu)定性功能于一體，成為中藥化學(xué)成分鑒定的有力分析工具。呋喃香豆素類化合物是多種中藥的主要活性成分，因其抗病毒、抗腫瘤、抗菌，特別是抗HIV活性而受到廣泛關(guān)注。呋喃香豆素中存在多種同分異構(gòu)體，如何在復(fù)雜體系中鑒定這些分子量相同、結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)體，成為主要以質(zhì)量數(shù)識別化合物的HPLC-MS技術(shù)面臨的難題。本研究即以呋喃香豆素類同分異構(gòu)體為研究對象，以北

2、沙參、白芷、前胡、獨活和補骨脂為研究載體，以HPLC-MS技術(shù)為分析手段，通過總結(jié)質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立HPLC-EPI液質(zhì)聯(lián)用新掃描方式，探討中藥復(fù)雜體系中同分異構(gòu)體鑒定的方法學(xué)，以期為同分異構(gòu)體的質(zhì)譜研究提供新方法和新思路。
　　半枝蓮(Scutellaria barbata)為唇形科植物半枝蓮(Scutellaria barbata)的干燥全草。《中國藥典》記載本品味辛、苦，性寒，歸肺、肝腎經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿清腫的

3、功能，是臨床常用中藥。黃酮類化合物是半枝蓮的主要生理活性物質(zhì)。本研究以專屬性強、靈敏度高的HPLC-MS技術(shù)為分析手段，采用水解和不水解2種血漿樣品處理方式，分別測定了大鼠灌胃半枝蓮后血漿中5種黃酮類成分的游離型含量和總量，初步探討了半枝蓮中黃酮類化合物的藥代動力學(xué)特征。
　　第一部分呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究
　　目的：研究呋喃香豆素類同分異構(gòu)體在軟電離技術(shù)(大氣壓化學(xué)電離源和電噴霧離子源)下質(zhì)譜裂解差異和規(guī)

4、律，建立穩(wěn)定、快速的可用于鑒定呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜方法。
　　方法：分別配制補骨脂素/異補骨脂素、花椒毒素/佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素/異歐前胡素、茴芹內(nèi)酯/異茴芹內(nèi)酯4對呋喃香豆素類同分異構(gòu)體對照品的甲醇儲備液，用甲醇-水(1:1，v/v)分別稀釋至濃度為1μg/mL。針泵進樣，流速為10μL/min。通過大氣壓化學(xué)電離源(APCI)和電噴霧離子源(ESI)下正負離子多級掃描、母離子掃描、中性丟失掃描研究其質(zhì)譜裂解途徑和差異，

5、采集在不同碰撞誘導(dǎo)解離電壓下子離子掃描中主要碎片的相對豐度值，采集時間為2 min。
　　結(jié)果：1.系統(tǒng)總結(jié)了區(qū)分呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的7個質(zhì)譜裂解規(guī)律，如相對豐度比區(qū)分法、利用特征性離子m/z203和185或用[M+NH4]+和[M+Na]+峰的相對豐度值區(qū)分取代基的位置等。2.發(fā)現(xiàn)區(qū)分呋喃香豆素同分異構(gòu)體的共性質(zhì)譜規(guī)律-相對豐度比法。公式為R=M/N，M和N分別代表互為同分異構(gòu)體的一對香豆素類化合物各自主要碎片離子的相對豐度

6、比值。對于單氧(雙氧)取代的化合物，當(dāng)R值大于1時，M為C-5(C-8較活潑取代基)取代的化合物，N為C-8(C-5較活潑取代基)取代的化合物。
　　結(jié)論：本法首次系統(tǒng)地將主要碎片離子豐度比法用于呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的區(qū)分?？偨Y(jié)的質(zhì)譜裂解規(guī)律穩(wěn)定性好、特征性強，可用于呋喃香豆素同分異構(gòu)體的質(zhì)譜快速鑒定。
　　第二部分 HPLC-EPI液質(zhì)掃描模式的建立及其在中藥成分分析中的應(yīng)用
　　目的：建立一種可獲得穩(wěn)定性高、重現(xiàn)

7、性好、專屬性強的化合物質(zhì)譜信息的分析方法，并用于多種中藥材復(fù)雜體系中化合物的分析與鑒定。
　　方法：配制補骨脂素/異補骨脂素、花椒毒素/佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素/異歐前胡素、茴芹內(nèi)酯/異茴芹內(nèi)酯4對呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的混合標準溶液，濃度分別為1μg/mL。采用超聲提取法制備北沙參、白芷、獨活、前胡和補骨脂的50％乙醇提取液，減壓蒸干，殘渣復(fù)溶于50％甲醇中，高速離心取上清液，作為供試品溶液。采用C18柱進行色譜分離，流動相為1 m

8、mol/L的醋酸銨水-甲醇，梯度洗脫。質(zhì)譜檢測采用ESI源，正離子掃描，增強型子離子掃描(EPI)模式，掃描離子為各個化合物的[M+H]+峰，線性離子阱填充時間為30 ms，Q0富集，在碰撞電壓為25、30和40 eV下進行檢測。對HPLC-EPI模式中分析物質(zhì)譜信息進行精密度與穩(wěn)定性的研究，記錄HPLC-EPI模式與多離子監(jiān)測-信息依賴-增強子離子掃描(HPLC-MRM-IDA-EPI)模式和母離子掃描-信息依賴-增強子離子掃描(HP

9、LC-PREC-IDA-EPI)模式在相同檢測條件下主要碎片離子的相對豐度值，采用SPSS16.0中的波動性差異進行統(tǒng)計比較分析。
　　結(jié)果：HPLC-EPI模式中，混合標準溶液和供試品溶液中待測化合物的碎片離子相對豐度值的精密度和穩(wěn)定性的相對標準偏差(RSD)均小于10％，質(zhì)譜信息較為穩(wěn)定。在HPLC-MRM-IDA-EPI與HPLC-PREC-IDA-EPI模式中，待測化合物的碎片離子豐度值波動在0.0-13.7％之間，而HP

10、LC-EPI模式中，待測化合物的碎片離子豐度值波動在0.0-2.3％之間。這說明在HPLC-EPI模式下更有利于得到穩(wěn)定的質(zhì)譜信息。
　　結(jié)論：本法穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、專屬性強，可用于在中藥復(fù)雜分析體中化合物穩(wěn)定質(zhì)譜信息的獲得和鑒定。
　　第三部分北沙參、白芷、前胡、獨活和補骨脂中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體HPLC-MS鑒定
　　目的：鑒定和識別北沙參、白芷、前胡、獨活和補骨脂中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。
　　方法：采

11、用超聲提取法制備5種藥材的50％乙醇提取液，減壓蒸干，殘渣復(fù)溶于50％甲醇中，高速離心取上清液進行HPLC-MS分析。聯(lián)合使用HPLC-EPI、HPLC-MRM-IDA-EPI和HPLC-PREC-IDA-EPI3種掃描模式，結(jié)合呋喃香豆素類同分異構(gòu)體的質(zhì)譜裂解規(guī)律，鑒定北沙參、白芷、前胡、獨活和補骨脂中呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。根據(jù)母離子掃描中同時出現(xiàn)的[M+H]+和[M+NH4]+峰離子信息判斷未知呋喃香豆素類化合物的分子量，根據(jù)3種

12、模式產(chǎn)生的碎片離子信息及主要裂解途徑上碎片離子的相對豐度比規(guī)律區(qū)分呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。采用C18柱進行色譜分離，流動相為1mmol/L醋酸銨水-甲醇，梯度洗脫。
　　結(jié)果：鑒定出5種中藥材中18對呋喃香豆素類同分異構(gòu)體。其中，北沙參中9對，白芷中12對，前胡中8對，獨活中7對，補骨脂中5對。
　　結(jié)論：HPLC-EPI掃描模式與呋喃香豆素類同分異構(gòu)體質(zhì)譜裂解規(guī)律的有機結(jié)合，可快速、穩(wěn)定的區(qū)分5種中藥復(fù)雜分析體系中18對呋

13、喃香豆素類同分異構(gòu)體。
　　第四部分半枝蓮中5種黃酮類成分的藥代動力學(xué)研究
　　目的：建立可同時測定大鼠血漿中游離型和結(jié)合型野黃芩苷、柚皮素、芹菜素、木犀草素和漢黃芩素含量的HPLC-MS方法，并用于大鼠灌胃給與半枝蓮提取物后該5種成分的藥代動力學(xué)研究。
　　方法：大鼠灌胃給與半枝蓮提取物(2.35 mL/kg)后，分別于給藥后0.08，0.5，4，5，6，8，12，24，36，48 h眼內(nèi)眥靜脈叢取血，每次取0.3

14、mL制備血漿樣品，將血漿均分成兩部分，分別采用酸水解并液-液萃取和直接液-液萃取兩種方法進行樣品預(yù)處理，提取溶劑為乙酸乙酯，磺胺甲惡唑為內(nèi)標。色譜柱為C18柱，流動相為0.01％乙酸水-甲醇(35:65，v/v)，運行時間為12.5 min。采用電噴霧離子源(ESI)，負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。5種被測成分和內(nèi)標的監(jiān)測離子對分別為野黃芩苷m/z461.1/285.1，柚皮素m/z271.0/119.0，芹菜素m/z2

15、69.0/117.0，木犀草素m/z285.0/132.9，漢黃芩素m/z283.0/268.0，磺胺甲惡唑m/z252.0/155.9。
　　結(jié)果：所有標準曲線在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r≥0.9915)，最低定量限(LLOQ)≤9.15ng/mL。日內(nèi)、日間精密度的相對標準偏差(RSD)均小于14.8％，相對誤差(RE)為-12.4-14.0％，提取回收率為53.8-84.2％，基質(zhì)效應(yīng)為81.9-103.3％。大鼠灌胃半枝蓮

16、提取物后，血漿中該5種成分的游離型t1/2在4.95-9.56 h之間，磁在0.001到0.0024之間，說明這5種成分在體內(nèi)消除較慢。除野黃芩苷出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象外，其余4種成分的游離型藥時曲線具有一致性。柚皮素、芹菜素、木犀草素和漢黃芩素結(jié)合型的AUC0→∞占總AUC0→∞的54.5-81.3％，并且結(jié)合型的Cmax是游離型的2倍之多，說明黃酮苷元類在體內(nèi)極易轉(zhuǎn)化成其結(jié)合形式存在并可能存在首過效應(yīng)。
　　結(jié)論：本法專屬性強、靈敏度