Na+-HCO3-共轉運體NBCn1與NBCn2表達產(chǎn)物多樣性及功能研究.pdf

1、SLC4家族蛋白是一類重要的酸堿調控蛋白，對維持機體酸堿平衡、調控細胞內(nèi)外pH和促進HCO3-的重吸收或者分泌具有重要的作用。SLC4家族共含有十個成員。其中NBCn1和NBCn2分別由Slc4a7和Slc4a10編碼，都是電中性的Na+/HCO3-共轉運蛋白。NBCn1和NBCn2在基因結構及蛋白一級序列上有著很高的同源性。
　　每個 SLC4家族基因都能夠通過選擇性轉錄或者選擇性剪接產(chǎn)生多種剪接異構體。選擇性轉錄和選擇性剪接對

2、SLC4家族蛋白的表達和轉運功能具有重要的調控作用。在此前的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Slc4a7含有3個可選擇性剪接外顯子cassette I、cassette II和cassette III，并且在人類組織中發(fā)現(xiàn)了NBCn1-A和NBCn1-F，在小鼠和大鼠組織中發(fā)現(xiàn)了NBCn1-B/C/D/E。人類NBCn1的Nt（N terminus，Nt）以11個特異性氨基酸殘基為起始，稱為MERF-NBCn1，而嚙齒類NBCn1的N端以16個特異性氨

3、基酸殘基為起始，稱為MEAD-NBCn1。在本研究開展之前并不知道人類基因組能否產(chǎn)生MEAD-NBCn1，小鼠組織能否產(chǎn)生MERF-NBCn1，也不清楚NBCn1的選擇性剪接元件對各個NBCn1剪接異構體表達和轉運功能的影響。
　　在本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)小鼠基因組既能夠產(chǎn)生MEAD-NBCn1，又能夠產(chǎn)生MERF-NBCn1。此外，我們發(fā)現(xiàn)了兩個新的可選擇性剪接外顯子exon3和exon11（又稱cassette IV）。根據(jù)小

4、鼠Slc4a7基因含有的2個5，UTR和5個可選擇性剪接外顯子，我們共鑒定了12個新的NBCn1剪接異構體。在這12個NBCn1剪接異構體中，有10個是全長型MEAD-NBCn1和MERF-NBCn1；1個是全長型NBCn1-R，NBCn1-R的Nt以21個特異性氨基酸起始，稱為MIPL-NBCn1；1個是NBCn1-Q，相比全長型MERF-NBCn1而言，NBCn1-Q缺失了Nt115個氨基酸殘基，稱為MDEL-NBCn1。通過電生理

5、學手段和生物素?；椒ǚ治鯪BCn1剪接異構體在爪蟾卵母細胞中的轉運活性和膜蛋白表達，我們發(fā)現(xiàn)NBCn1的特異性Nt和可選擇性剪接元件能夠影響NBCn1的轉運功能和上膜能力。MEAD型Nt傾向于提高而cassette IV傾向于減少NBCn1的上膜表達，cassette II、cassette III和cassette IV都傾向于增強NBCn1的單分子轉運活性。當在爪蟾卵母細胞中表達時，MIPL-NBCn1即NBCn1-R能夠表現(xiàn)出正

6、常的Na+/HCO3-轉運活性，而MDEL-NBCn1即NBCn1-Q的Na+/HCO3-轉運活性較為微弱，但是NBCn1-Q仍能表現(xiàn)出明顯的Na+電導活性。
　　與Slc4a7基因類似，Slc4a10也能夠通過選擇性轉錄和選擇性剪接產(chǎn)生多種轉錄本。我們課題組的前期western blot結果表明，MCDL-NBCn2在大鼠腎臟中的蛋白表達非常豐富，但是根據(jù)已有的cDNA序列設計引物，無法擴增得到MCDL-NBCn2 cDNA全長

7、，只能夠得到起始密碼子“ATG”下游片段。因此我們猜測，在大鼠腎臟中，Slc4a10的MCDL-NBCn2轉錄本很有可能含有一個新的5，UTR，并且MCDL-NBCn2的轉錄受到一個新的啟動子調控。
　　通過5，RACE和熒光素酶活性分析，我們發(fā)現(xiàn)大鼠 Slc4a10基因含有一個新的啟動子（P2），從此啟動子進行轉錄，大鼠Slc4a10既能夠產(chǎn)生MCDL-NBCn2，又能夠產(chǎn)生Nt截短的NBCn2剪接異構體。Nt截短的NBCn2異

8、構體以“MHAN”為起始，稱為MHAN-NBCn2。當在neuro-2a細胞中外源表達時，MHAN-NBCn2幾乎全部滯留在細胞質中。通過一系列的Nt截短，我們發(fā)現(xiàn)NBCn2的Nt氨基酸序列“HDLFTEL”對 NBCn2的正常上膜具有重要的作用。當全長型 NBCn2與 Nt截短型 NBCn2在neuro-2a細胞中共表達時，全長型NBCn2能夠顯著增強Nt截短型NBCn2的上膜表達。免疫共沉淀和雙分子熒光互補實驗表明在 neuro-2

9、a細胞中，全長型 NBCn2與Nt截短型NBCn2能夠形成異源二聚體。最后，我們的實驗結果顯示獨立的Nt結構域仍然能夠與Nt截短型NBCn2相互作用并增強Nt截短型NBCn2在neuro-2a細胞中的上膜表達。
　　通過比較分析SLC4家族的NBCn1、NBCn2和NBCe2的Nt截短蛋白在neuro-2a細胞中的定位，結合我們在本研究中和別的課題組的電生理研究成果，我們發(fā)現(xiàn)NBCn1、NBCn2和NBCe2的Nt可變區(qū)1（var