小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs在前列腺和脾臟及巨噬細(xì)胞的功能性表達(dá)研究.pdf

1、小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs(proton-coupled oligopeptide transporters)是質(zhì)子依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)體，介導(dǎo)一系列短鏈肽和擬肽類物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)。POTs家族由SLC15A基因編碼，并由四個(gè)成員組成，分別是SLC15A1(PepT1)，SLC15A2(PepT2)，SLC15A4(PHT1)和SLC15A3(PHT2)。其中PepT1和PepT2是負(fù)責(zé)機(jī)體內(nèi)二肽、三肽的細(xì)胞攝取的質(zhì)子偶聯(lián)的轉(zhuǎn)運(yùn)體。PepT1屬低

2、親和力，高容量轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要分布于小腸，介導(dǎo)飲食中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的二肽、三肽及其它結(jié)構(gòu)相似的化合物的吸收，此外β-內(nèi)酰胺類抗生素及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等藥物均是PepT1的底物。與PepT1不同，PepT2屬高親和力，低容量的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體，其底物識(shí)別譜與PepT1相似。PepT2主要分布于腎，肺，腦脈絡(luò)叢等組織，而在小腸組織中基本沒(méi)有表達(dá)。PHT1和PHT2是后續(xù)分別在腦和淋巴系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的另兩個(gè)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體成員，其中PHT1主要分布于腦，視

3、網(wǎng)膜等組織，起到吸收神經(jīng)肽和神經(jīng)調(diào)節(jié)因子的降解產(chǎn)物的作用，而PHT2在脾，肺和胸腺等免疫相關(guān)組織中有較高mRNA表達(dá)，提示其在免疫系統(tǒng)中的作用。PHT1和PHT2除識(shí)別二、三肽化合物為底物之外，還介導(dǎo)組氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，目前關(guān)于PHT1和PHT2的生理功能及調(diào)節(jié)尚無(wú)更多報(bào)道。綜合以上POTs的各種特性，PepT1和PepT2是非常有優(yōu)勢(shì)的擬肽類藥物的靶標(biāo)，PHT2在免疫系統(tǒng)中有重要作用。本文研究了生理和病理狀態(tài)下POTs在前列腺組織及細(xì)胞中的

4、表達(dá)及PepT2在前列腺的分布，評(píng)價(jià)其作為藥物吸收的靶標(biāo)的意義。本文還研究了PepT2在NOD1(核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體1)和NOD2(核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體2)信號(hào)通路中的作用，以及炎癥刺激對(duì)脾臟及巨噬細(xì)胞中PepT2和PHT2表達(dá)和功能的影響。
　　 1.小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs在前列腺中的表達(dá)研究
　　 采用Western Blot和Real-time PCR的方法，考察PepT1，PepT2，PHT1和PHT2在小鼠前

5、列腺中mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示PepT2和PHT1在前列腺中mRNA表達(dá)較高，但僅有PepT2蛋白顯示免疫條帶。以免疫組化方法對(duì)PepT2在小鼠前列腺組織的表達(dá)進(jìn)行定位研究發(fā)現(xiàn)，PepT2主要在前列腺上皮細(xì)胞頂側(cè)表達(dá)，在基底細(xì)胞中也略有表達(dá)。為更好地了解PepT2在前列腺中表達(dá)的生理意義，本文考察了不同年齡小鼠前列腺組織中PepT2的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠發(fā)育階段，PepT2 mRNA和蛋白表達(dá)均隨周齡增大而增加，而達(dá)到

6、成年(8周齡)后趨于平穩(wěn)，表明PepT2在性成熟的前列腺中發(fā)揮作用。人前列腺組織中POTs的mRNA表達(dá)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PepT2和PHT2 mRNA表達(dá)水平較高，PHT1較低，而PepT1基本沒(méi)有檢測(cè)到。對(duì)16例前列腺增生和前列腺癌的臨床樣本的POTs表達(dá)的比較研究，前列腺癌樣本中PepT2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著低于前列腺增生樣本，且前列腺癌樣本中PHT1 mRNA表達(dá)也顯著低于增生樣本，推測(cè)腫瘤環(huán)境可能影響PepT2和PHT1

7、的表達(dá)。
　　 人前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1和人前列腺癌細(xì)胞PC-3細(xì)胞中有較低的PepT2，PHT1和PHT2的表達(dá)。為考察炎癥環(huán)境對(duì)POTs表達(dá)的影響，本文以致炎因子IFNγ和TNFα誘導(dǎo)刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)后，檢測(cè)細(xì)胞中PepT2，PHT1和PHT2的mRNA表達(dá)變化，結(jié)果顯示IFNγ(50ng/mL)和TNFα(50ng/mL)刺激RWPE-1細(xì)胞48小時(shí)后，顯著誘導(dǎo)PHT2 mRNA表達(dá)(P<0.001)，但卻使Pep

8、T2表達(dá)降低(P<0.01)，而在PC-3細(xì)胞中，IFNγ(50ng/mL)和TNFα(50ng/mL)作用48h后，PHT2 mRNA表達(dá)均顯著增加(P<0.001)，但對(duì)PepT2和PHT1的表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。PHT2在RWPE-1和PC-3細(xì)胞中的基礎(chǔ)表達(dá)均較低，而致炎因子的刺激作用顯著誘導(dǎo)了PHT2的表達(dá)，表明炎癥因子顯著上調(diào)PHT2表達(dá)，提示其在細(xì)胞免疫應(yīng)激中可能有重要作用。
　　 2.小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs

9、在小鼠脾臟中的表達(dá)分布及在脾巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)功能研究
　　 本章研究了小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體PepT1，PepT2，PHT1和PHT2在小鼠脾臟中的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示PepT2和PHT2在小鼠脾臟中表達(dá)較高。為考察PepT2和PHT2在脾臟中的分布和生理功能，本研究以貼壁培養(yǎng)法分離了脾臟淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，分別考察其中PepT2和PHT2表達(dá)，結(jié)果表明，PepT2主要在巨噬細(xì)胞中表達(dá)，而PHT2在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均有相當(dāng)水平的表

10、達(dá)。
　　 POTs的熒光底物β-Ala-Lys(AMCA)在小鼠脾巨噬細(xì)胞的積聚研究顯示，其積聚呈pH依賴性，在pH為6.0時(shí)積聚最強(qiáng)，β-Ala-Lys(AMCA)的積聚動(dòng)力學(xué)顯示其在脾巨噬細(xì)胞中積聚符合米氏方程，其Km=75.5±15μM，Vmax=25.4±2.1 pM/minper mg protein。POTs的其它經(jīng)典底物(抑制劑)，如肌肽，Gly-Sar，頭孢氨芐均顯著抑制β-Ala-Lys(AMCA)(50μM

11、)在脾巨噬細(xì)胞內(nèi)的積聚(P<0.01)，而組氨酸(PHT1和PHT2底物，非PepT1和PepT2底物，5mM)未能明顯改變?chǔ)?Ala-Lys(AMCA)在細(xì)胞內(nèi)積聚；此外，POTs經(jīng)典底物Gly-Sar在脾巨噬細(xì)胞中積聚也被POTs底物肌肽(5mM)明顯抑制，而組氨酸對(duì)其沒(méi)有影響。上述結(jié)果表明PepT2，而非PHT2介導(dǎo)脾巨噬細(xì)胞對(duì)POTs底物的攝取。
　　 3.小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs在NOD1，NOD2信號(hào)通路中的作用
　

12、　 NOD1和NOD2是固有免疫反應(yīng)中的兩個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)受體，分別可識(shí)別γ-iE-DAP和MDP為配體，激活NF-κB活性，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，產(chǎn)生炎癥因子。本章以小鼠脾巨噬細(xì)胞和THP-1巨噬細(xì)胞為研究模型，考察PepT2在γ-iE-DAP和MDP誘導(dǎo)的NOD1和NOD2信號(hào)通路中的作用。結(jié)果顯示，在小鼠脾巨噬細(xì)胞中，PepT2底物及抑制劑肌肽(5mM)顯著抑制γ-iE-DAP(10μg/mL)和MDP(10μg/mL)誘導(dǎo)的炎

13、癥因子IL-6和TNFα mRNA表達(dá)的增加(P<0.05)，但不影響IL-6和TNFα的細(xì)胞外蛋白分泌，提示PepT2參與γ-iE-DAP和MDP的入細(xì)胞過(guò)程，影響NOD1和NOD2信號(hào)通路，而不影響炎癥因子的可溶性分泌。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs在三株巨噬細(xì)胞系中表達(dá)情況各異，其中J774a.1細(xì)胞中僅PHT2有較高表達(dá)，THP-1細(xì)胞中PepT2，PHT1和PHT2均有較高表達(dá)，而在RAW264.7細(xì)胞中四個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)均較低，因此本文以T

14、HP-1巨噬細(xì)胞為研究模型進(jìn)一步驗(yàn)證PepT2在NOD1和NOD2信號(hào)通路中的作用，結(jié)果表明在THP-1細(xì)胞中γ-iE-DAP(10μg/mL)誘導(dǎo)增加IL-6和TNFα的mRNA表達(dá)，且肌肽(5mM)和組氨酸(5mM)均顯著抑制γ-iE-DAP對(duì)IL-6(P<0.01)和TNFα(P<0.05)的誘導(dǎo)作用，表明PepT2在THP-1細(xì)胞中也參與NOD1信號(hào)通路，而組氨酸的對(duì)NOD1信號(hào)通路激活的抑制效應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。PepT2介

15、導(dǎo)NOD1和NOD2配體γ-iE-DAP和MDP的轉(zhuǎn)運(yùn)，間接參與NOD1/2信號(hào)通路。
　　 4.脂多糖致炎對(duì)巨噬細(xì)胞和小鼠體內(nèi)POTs的表達(dá)的影響
　　 小肽轉(zhuǎn)運(yùn)體POTs的表達(dá)和功能受多種因素調(diào)節(jié)，本章以內(nèi)毒素脂多糖(LPS)刺激巨噬細(xì)胞及小鼠致炎模型考察了炎癥刺激對(duì)POTs mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示在兩種細(xì)胞中給予LPS(10ng/mL)刺激2小時(shí)后，PepT2和PHT1表達(dá)沒(méi)有顯著變化，但PHT2表達(dá)明顯增加

16、(THP-1巨噬細(xì)胞：P<0.01，J774a.1細(xì)胞：P<0.001)，該結(jié)果與前列腺細(xì)胞中的研究結(jié)果一致，此外LPS致炎的小鼠體內(nèi)脾肺等組織POTs表達(dá)均增加3-5倍表明炎癥刺激上調(diào)PHT2表達(dá)，提示PHT2可能在免疫應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PepT1和PepT2為細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，而PHT1和PHT2主要定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)溶酶體等細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中，細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)，PHT2表達(dá)的明顯增加可能發(fā)揮將溶酶體中消化產(chǎn)生的降解產(chǎn)物