結(jié)核桿菌LAM寡糖綴合物疫苗的合成與免疫活性研究.pdf

1、肺結(jié)核是一種具有高傳染性和致死率的疾病。隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)和使用，人們曾經(jīng)很好地控制了它的傳播，但是近年來，這一疾病再次威脅到人類的健康和生命。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計，最近幾年全世界感染肺結(jié)核的人數(shù)在逐年遞增，其中有三分之一感染者死亡?？股氐拇罅渴褂檬窃斐蛇@一現(xiàn)象的主要原因。較長的治療周期和多種抗生素的聯(lián)合使用一方面給病人的身體造成了非常大的傷害，另一方面還導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的不斷增強(qiáng)。此外，與艾滋病的交叉感染也是導(dǎo)致其死亡率逐年

2、上升的原因之一。艾滋病病毒會對人體的免疫系統(tǒng)造成傷害，艾滋病患者也就更容易感染肺結(jié)核，感染后的患者很難治愈，通常在幾個月后就會死亡?？ń槊?BCG)是預(yù)防結(jié)核病的唯一疫苗，但是在許多地區(qū)它對結(jié)核病的保護(hù)力從0到80％不等，對于有免疫缺陷的病人，BCG接種還有可能導(dǎo)致結(jié)核的全身播散。因此，人們需要研究開發(fā)更為安全、有效的疫苗來預(yù)防結(jié)核病的傳播。
　　到目前為止，科學(xué)家們也研發(fā)了一些新的肺結(jié)核候選疫苗，它們的免疫效果已經(jīng)通過臨床前的動

3、物實驗證明，個別候選疫苗已經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ或Ⅱ期臨床實驗，但是這些疫苗都以蛋白或肽作為抗原決定基。與蛋白或多肽疫苗相比，糖綴合物疫苗具有很大的優(yōu)勢:首先，多糖類物質(zhì)一般都存在于細(xì)胞表面，這就可以保證人體在受到細(xì)菌感染的過程中能夠快速識別并產(chǎn)生免疫反應(yīng);其次，糖的結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，不會像蛋白質(zhì)和核酸那樣容易發(fā)生變異，接種糖疫苗后可能會達(dá)到終身免疫的效果;另外，研究證明多糖類物質(zhì)具有非常重要的生物功能，尤其是在細(xì)菌感染人體的最初階段。在許多已

4、經(jīng)上市的基于糖抗原的疫苗中（如肺炎鏈球菌疫苗、B型流感嗜血桿菌疫苗、C群腦膜炎球菌多糖綴合物疫苗等），糖抗原已經(jīng)被證明是一種非常重要的抗原組分，因此我們相信基于糖抗原的肺結(jié)核疫苗的研究是非常重要的。
　　脂肪阿拉伯甘露聚糖(LAM)是結(jié)核桿菌細(xì)胞表面的一種非常重要的脂多糖。研究證明，LAM在結(jié)核桿菌感染人體的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。例如，它能抑制γ-干擾素介導(dǎo)的活化、巨噬細(xì)胞活化、觸發(fā)和殺傷活性、T-細(xì)胞活化等，這些都和免疫反

5、應(yīng)息息相關(guān)。因此，LAM是研發(fā)肺結(jié)核疫苗的良好靶抗原。為此，我們設(shè)計了三個源自LAM非還原端的阿拉伯寡糖片段，其結(jié)構(gòu)中都含有α-(1→2)連接的吡喃型甘露二糖。并通過合理的路線設(shè)計，以化學(xué)手段立體選擇性的合成了這些寡糖半抗原，然后與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)和單磷酰類脂A(MPLA)綴合得到LAM寡糖-綴合物候選疫苗，最后對疫苗的免疫活性進(jìn)行了初步測試。本論文主要包括以下三個部分:
　　一、對結(jié)核桿菌LAM寡糖及其衍生物的合成與性能研

6、究做了詳細(xì)的綜述。(1)PIM寡糖的合成。其主要合成思路大體類似，根據(jù)肌醇上六個羥基的反應(yīng)活性不同，經(jīng)過合理的保護(hù)基策略和路線設(shè)計，首先合成特定位置羥基裸露的肌醇衍生物作為受體，然后與不同的甘露糖供體進(jìn)行糖苷化，最后進(jìn)行肌醇特定位置的磷酸化得到全保護(hù)的PIM衍生物，脫去全部保護(hù)基得到終產(chǎn)物。(2)LAM阿拉伯寡糖的合成。阿拉伯寡糖片段中含有α-(1→5)、α-(1→3)以及β-(1→2)等連接方式，其合成也相對比較困難，所以大部分研究主

7、要集中在β-(1→2)連接的阿拉伯糖苷鍵的合成方法學(xué)上，主要包括:分子內(nèi)轉(zhuǎn)移法、利用構(gòu)像限制作用選擇合適的保護(hù)基、氫鍵誘導(dǎo)法等等。(3)LAM小分子類似物的合成。由于LAM結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其衍生物的合成也是非常困難的，只有少數(shù)人設(shè)計合成了非常簡單的分子，且多數(shù)都沒有涉及到β-(1→2)連接的阿拉伯糖苷鍵的構(gòu)建。
　　二、LAM阿拉伯寡糖-蛋白綴合物的合成。(1)LAM非還原端四糖的合成:該合成以D-阿拉伯糖和D-甘露糖為起始原料，采

8、用[2+2]的糖苷化策略，通過構(gòu)建甘露二糖供體和阿拉伯二糖受體來實現(xiàn)。在合成阿拉伯二糖時，反應(yīng)生成α和β異構(gòu)體的混合物，目標(biāo)產(chǎn)物通過硅膠柱分離純化，其構(gòu)型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學(xué)位移確定。在合成四糖時也得到了α和β異構(gòu)體的混合物，產(chǎn)物也可以很容易地通過硅膠柱分離，其構(gòu)型根據(jù)甘露糖異頭碳的1JCH耦合常數(shù)確定。(2)LAM七糖的合成:該合成采用[5+2]的糖苷化策略，充分利用乙酰基的鄰基參與作用控制立體選擇性，且由于α和β異構(gòu)體是

9、在合成供體的過程中產(chǎn)生的，避免了在最后階段糖苷化生成異構(gòu)體，關(guān)鍵中間體的構(gòu)型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學(xué)位移確定。(3)LAM十一糖的合成:與七糖的合成類似，該合成采用了[9+2]的糖苷化策略。在合成供體的過程中通過雙糖苷化的方法快速構(gòu)建分枝型阿拉伯糖苷鍵，整個路線同樣充分利用了乙?；泥徎鶇⑴c作用控制立體選擇性，只有一步反應(yīng)產(chǎn)生α和β異構(gòu)體，其構(gòu)型根據(jù)13C NMR上異頭碳的化學(xué)位移確定。(4)寡糖與BSA和KLH的綴合:以雙琥珀

10、酰亞胺戊二酸酯為交聯(lián)劑進(jìn)行。糖蛋白綴合物的糖含量用硫酸-苯酚法分析計算得到，且BSA綴合物的糖含量可以進(jìn)一步通過MALDI-TOF質(zhì)譜確定，KLH綴合物的糖含量通過SDS-PAGE分析確定。(5)LAM寡糖-KLH綴合物的初步免疫結(jié)果表明，三個寡糖綴合物均能夠引起特異性的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生一定滴度的抗體。
　　三、LAM阿拉伯寡糖-MPLA綴合物的合成。最初我們計劃將寡糖連接在MPLA的6'-O位置，通過將6'位羥基衍生化引入炔基，接

11、著和含有疊氮基的LAM寡糖經(jīng)過點擊化學(xué)“click”反應(yīng)完成綴合。我們首先采用收斂的策略高效的合成了6'位羥基的MPLA衍生物，接著和溴丙炔在氫化鈉存在的條件下反應(yīng)引入炔丙基，但是經(jīng)過核磁共振二維譜圖鑒定，MPLA4'-O位的磷脂?；w移到了6'-O位，而炔丙基被引入到了4'-O位置。后來我們嘗試用戊炔酸與6'位羥基縮合成酯，但是發(fā)現(xiàn)酯鍵穩(wěn)定性較差，容易水解斷開。為了解決這一難題，我們將6'位羥基換成氨基，然后與戊炔酸縮合形成穩(wěn)定的酰胺

12、鍵，接著與LAM四糖經(jīng)過“click”反應(yīng)綴合，最后脫去全部保護(hù)基得到LAM寡糖-MPLA綴合物。此外，我們還合成了1-O位連接的LAM四糖-MPLA綴合物作為陽性對比。糖脂類化合物的質(zhì)譜分析一直是令人們頭痛的問題，這類化合物難于離子化，需要通過特殊的質(zhì)譜條件才能完成。我們采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀對所合成的綴合物進(jìn)行了質(zhì)譜分析，其中6'位連接的四糖-MPLA綴合物以2,5-二羥基苯甲酸(DHB)為基質(zhì)，三氟乙酸(TFA)為離子化試劑