植物葉綠體遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、葉綠體(chloroplast)是高等植物細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，它除進(jìn)行光合作用外還參與脂肪酸、核苷酸、淀粉和氨基酸等許多物質(zhì)的生物合成。葉綠體還是一個(gè)半自主性的細(xì)胞器，含有自己的基因組DNA(ctDNA)，能夠進(jìn)行自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及合成蛋白質(zhì)，至少有100余種葉綠體特有的蛋白質(zhì)是在葉綠體內(nèi)部合成的。與傳統(tǒng)的核轉(zhuǎn)化相比，葉綠體轉(zhuǎn)化具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性。這一領(lǐng)域的相關(guān)研究不僅在理論上極大地豐富了有關(guān)葉綠體的研究，并為細(xì)胞器轉(zhuǎn)化、構(gòu)建新型生物反

2、應(yīng)器(bioreactor)等奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 Sidorov等的研究表明：在漫長(zhǎng)的演變進(jìn)化過(guò)程中，葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)非常保守。在作物之間，不一定必須構(gòu)建特定的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。因此，本研究在含有壯觀霉素抗性(spectinomycin resistance)基因及綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因的煙草葉綠體表達(dá)載體pDK53的基礎(chǔ)上，連入能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定存在的黃瓜線粒體類質(zhì)粒pC3

3、全序列，構(gòu)建黃瓜葉綠體表達(dá)載體pDK53-pC3，以期增加黃瓜葉綠體轉(zhuǎn)化過(guò)程中載體整合或獨(dú)立存在的機(jī)會(huì)。
　　 本研究以“津研4號(hào)”黃瓜為試材，首先分離純化黃瓜葉綠體，摸索其體外培養(yǎng)條件，通過(guò)顯微觀察、臺(tái)盼藍(lán)染色、希爾反應(yīng)及I2-KI染色等方法檢測(cè)葉綠體體外培養(yǎng)效果，取得了較為理想的結(jié)果。進(jìn)一步向培養(yǎng)體系中添加氨基酸、激素、各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及改變培養(yǎng)體系pH等以期優(yōu)化葉綠體體外培養(yǎng)條件，但并未取得明顯效果。
　　 對(duì)黃瓜離

4、體葉綠體的電轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行探索，用電轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建的帶有外源基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入黃瓜離體葉綠體中，通過(guò)PCR擴(kuò)增外源基因g，證明葉綠體表達(dá)載體pDK53、pDK53-pC3已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入離體的黃瓜葉綠體中，并且葉綠體在體外培養(yǎng)18天甚至更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，轉(zhuǎn)入的外源DNA仍然可以檢測(cè)到。但是，質(zhì)粒在離體葉綠體中的存在方式、外源基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)情況尚未可知，確切的結(jié)論還有待進(jìn)一步研究。
　　 萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhar

5、dtii)含有1個(gè)大型杯狀葉綠體，約占整個(gè)細(xì)胞體積的40％～60%。本研究以萊茵衣藻細(xì)胞壁和精氨酸缺陷型CW15品系為試材，采用電轉(zhuǎn)化方法將煙草葉綠體表達(dá)載體pDK53導(dǎo)入衣藻葉綠體中，通過(guò)PCR擴(kuò)增外源基因gfp和熒光顯微鏡觀察，證明葉綠體表達(dá)載體pDK53已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入衣藻葉綠體中。但是在對(duì)衣藻轉(zhuǎn)化子進(jìn)行同質(zhì)化篩選過(guò)程中，外源基因丟失了。
　　 此外，本研究以“津研4號(hào)”黃瓜子葉和下胚軸為外植體，比較了外植體切割和接種方式以及