糖皮質(zhì)激素在主動(dòng)脈夾層血管重構(gòu)中的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、隨著社會(huì)老齡化的到來(lái)和人民生活水平的提高，血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率逐年上升，而以主動(dòng)脈夾層(aortic dissection,AD)為代表的主動(dòng)脈擴(kuò)張病是其中最兇險(xiǎn)的一類。盡管AD的治療方式從巨創(chuàng)向微創(chuàng)發(fā)生了革命性變化，夾層的并發(fā)癥率和死亡率有了明顯降低，但仍有很多患者在明確診斷前或開(kāi)始救治前即因夾層破裂而死亡。因此，闡明AD發(fā)病和轉(zhuǎn)歸的機(jī)制，對(duì)改善夾層預(yù)后至關(guān)重要。有證據(jù)表明血管炎癥反應(yīng)在主動(dòng)脈血管重構(gòu)過(guò)程中起著重要作用，而糖皮質(zhì)激素因

2、其強(qiáng)大的抗炎作用被廣泛用于臨床。最新的隨機(jī)對(duì)照臨床研究表明術(shù)前單次應(yīng)用大劑量的糖皮質(zhì)激素，在沒(méi)有增加不良事件發(fā)生率的基礎(chǔ)上能明顯降低腹主動(dòng)脈瘤患者腔內(nèi)隔絕術(shù)后全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生率，但糖皮質(zhì)激素與AD的關(guān)系仍模糊不清。
　　目的:探討糖皮質(zhì)激素在AD的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的作用，并進(jìn)一步闡明糖皮質(zhì)激素參與主動(dòng)脈血管重構(gòu)的細(xì)胞分子機(jī)制。
　　方法:1、臨床樣本研究:在符合倫理審查和患者知情同意情況下，收集AD、非破裂主動(dòng)脈瘤

3、(non-ruptured aortic aneurysm，nAA)和健康對(duì)照者的血液標(biāo)本，放射免疫法檢測(cè)血清皮質(zhì)醇、血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）的含量;同時(shí)收集行開(kāi)放手術(shù)的AD、nAA患者和遺體捐獻(xiàn)者的主動(dòng)脈，免疫組化法檢測(cè)主動(dòng)脈中糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GCR)表達(dá)水平;收集夾層患者的臨床信息進(jìn)行多元線性回歸分析，探討血清皮質(zhì)醇含量

4、的影響因素。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究:在獲得第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用協(xié)會(huì)的批準(zhǔn)后，切除80只C57BL/6小鼠的雙側(cè)腎上腺，按2∶2∶1完全隨機(jī)分成三組，用血管緊張素Ⅱ建立AD模型，外加糖皮質(zhì)激素或溶劑對(duì)照干預(yù)，三組分別為糖皮質(zhì)激素干預(yù)組、模型組、溶劑對(duì)照組:記錄小鼠的死亡時(shí)間，Kaplan-Meier曲線計(jì)算小鼠累積生存率;血管緊張素Ⅱ干預(yù)前后每周尾動(dòng)脈測(cè)壓，驗(yàn)證血管緊張素Ⅱ是否起效;解剖獲取小鼠主動(dòng)脈，借助Image-ProPlus軟件測(cè)

5、量小鼠主動(dòng)脈外徑;蘇木素-伊紅染色，測(cè)量主動(dòng)脈中膜厚度及觀察夾層發(fā)生率;Masson染色，檢測(cè)主動(dòng)脈膠原容積分?jǐn)?shù);免疫組化法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈GCR表達(dá)及巨噬細(xì)胞的含量。3、細(xì)胞分子研究:體外培養(yǎng)入主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(humanaortic smooth muscle cell，HA-SMC)和巨噬細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖皮質(zhì)激素對(duì)巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、基質(zhì)金屬

6、蛋白酶-2抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)的影響;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)糖皮質(zhì)激素對(duì)HA-SMC遷移的影響，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)糖皮質(zhì)激素對(duì)HA-SMC表型轉(zhuǎn)換的影響;建立HA-SMC和巨噬細(xì)胞間接共培養(yǎng)體系，細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞共培養(yǎng)及糖皮質(zhì)激素對(duì)HA-SMC凋亡的影響，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞共培養(yǎng)及糖皮

7、質(zhì)激素對(duì)HA-SMC遷移的影響;高通量蛋白微陣列芯片檢測(cè)細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵因子，并用相應(yīng)因子的中和抗體驗(yàn)證其作用;應(yīng)激和凋亡通路試劑盒檢測(cè)關(guān)鍵因子參與血管重構(gòu)的信號(hào)分子通路，western blot驗(yàn)證該信號(hào)分子的變化。
　　結(jié)果:1、臨床樣本研究:2012年10月至2013年12月，共收集在我血管外科中心治療經(jīng)可靠影像學(xué)方法診斷的82例AD，68例nAA及在我院體檢中心體檢的76例健康者的血液樣本，三組人群血清皮質(zhì)醇含量分別為

8、173.98±23.44 ng/mL，136.60±21.83 ng/mL和129.00±27.56 ng/mL，AD組明顯高于nAA組(P＜0.001)和健康體檢組(P＜0.001);三組人群血漿ACTH含量分別為26.76±7.41 pg/mL，24.75±8.21pg/mL和25.64±7.38 pg/mL，三組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同期收集行開(kāi)放手術(shù)的8例AD，8例nAA和8例遺體捐獻(xiàn)者的主動(dòng)脈，三組GCR含量分別為14.25±1.

9、31％，13.39±1.42％和12.55±2.12％，未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;收集夾層患者的臨床信息行多元回歸分析發(fā)現(xiàn)夾層裂口數(shù)目是血清皮質(zhì)醇含量的影響因素（偏回歸系數(shù)0.920，P=0.029）。2、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究:最終納入糖皮質(zhì)激素干預(yù)組、模型組和溶劑對(duì)照組分析的小鼠數(shù)量分別是31、27和13;模型組與糖皮質(zhì)激素干預(yù)組(P=0.139)或溶劑對(duì)照組(P=0.107)的累積生存率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Log-rank檢驗(yàn)）;模型組的小鼠收縮壓在血

10、管緊張素Ⅱ干預(yù)后明顯高于溶劑對(duì)照組，在血管緊張素Ⅱ干預(yù)后7天、14天、21天明顯低于糖皮質(zhì)激素干預(yù)組;模型組的小鼠主動(dòng)脈外徑明顯大于溶劑對(duì)照組（升主動(dòng)脈:1458.49±257.96μmvs.1094.61±154.57μm，P＜0.001;主動(dòng)脈弓:1449.48±290.34μmvs.986.38±151.16μm，P＜0.001;降主動(dòng)脈:1343.47±238.48μmvs.980.36±98.48μm，P＜0.001)，模型組

11、小鼠的升主動(dòng)脈外徑明顯大于糖皮質(zhì)激素干預(yù)組（1458.49±257.96μmvs.1279.17±204.241m，P=0.005），主動(dòng)脈弓和降主動(dòng)脈外徑無(wú)明顯差異;模型組(29.6％)的小鼠AD發(fā)生率明顯高于糖皮質(zhì)激素干預(yù)組(6.5％，P=0.034)和溶劑對(duì)照組(0％，P=0.037);模型組小鼠的主動(dòng)脈中膜厚度明顯高于溶劑對(duì)照組（89.6±14.7μmvs.68.4±11.6μm，P＜0.001），但糖皮質(zhì)激素干預(yù)組與模型組之間

12、無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（89.8±13.5μm vs.89.6±14.7μm，P=0.937）;模型組（24.2±6.0％）小鼠的主動(dòng)脈膠原容積分?jǐn)?shù)明顯低于溶劑對(duì)照組（31.7±6.3％，P=0.001）和糖皮質(zhì)激素干預(yù)組(30.1±8.2％，P=0.003);模型組（9.3±3.0％）小鼠的主動(dòng)脈GCR水平與糖皮質(zhì)激素干預(yù)組(8.5±2.1％，P=0.235)或溶劑對(duì)照組（7.6±1.1％，P=0.115）無(wú)明顯不同;但模型組（9.3±3.5％

13、）小鼠的主動(dòng)脈巨噬細(xì)胞含量明顯高于溶劑對(duì)照組（2.2±1.0％，P＜0.001）或糖皮質(zhì)激素干預(yù)組（7.4±3.2％，P=0.041）。3、細(xì)胞分子研究:結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素能明顯抑制巨噬細(xì)胞分泌MMP-2，對(duì)TIMP-2的分泌無(wú)明顯影響;另外，高濃度糖皮質(zhì)激素抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，低濃度糖皮質(zhì)激素促進(jìn)TNF-α的分泌;糖皮質(zhì)激素減少HA-SMC的遷移，抑制HA-SMC向分泌型表型轉(zhuǎn)換;HA-SMC與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)抑制了HA-SMC

14、的凋亡，糖皮質(zhì)激素加強(qiáng)這一效應(yīng)，但對(duì)細(xì)胞遷移無(wú)影響;高通量蛋白微陣列鑒定出白介素-6（interleuin-6，IL-6）和可溶性腫瘤壞死因子Ⅱ型受體(solubletumor necrosis factor receptorⅡ，TNF-sRⅡ)可能是細(xì)胞間相互作用的關(guān)鍵因子，但抗體中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TNF-sRⅡ是關(guān)鍵因子，IL-6的作用未得到驗(yàn)證。細(xì)胞共培養(yǎng)或糖皮質(zhì)激素干預(yù)時(shí)，應(yīng)激和凋亡通路試劑盒檢測(cè)到bad、HSP27、p38MAPK

15、和IkBa信號(hào)分子磷酸化水平的變化，western blot結(jié)果表明細(xì)胞共培養(yǎng)和糖皮質(zhì)激素干預(yù)影響了p38MAPK和HSP27的磷酸化通路，參與血管重構(gòu)。
　　結(jié)論:糖皮質(zhì)激素正性調(diào)控主動(dòng)脈血管重構(gòu)，對(duì)AD的發(fā)生起著保護(hù)性作用。AD患者的血清皮質(zhì)醇含量升高是機(jī)體為應(yīng)對(duì)病理性血管重構(gòu)作出的積極反應(yīng)。糖皮質(zhì)激素降低巨噬細(xì)胞分泌MMP-2減少主動(dòng)脈膠原的降解，抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α減輕管壁炎癥反應(yīng)，抑制HA-SMC遷移維持管壁SMC