ColⅡ-CS-HA-PVA軟骨仿生支架的制備.pdf

1、由創(chuàng)傷或骨病引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損臨床十分常見，常導致關(guān)節(jié)頑固性疼痛、關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，嚴重影響患者日常活動和生活質(zhì)量［1,2］，是目前肢體殘障的主要原因之一。關(guān)節(jié)軟骨缺少血管、神經(jīng)及淋巴系統(tǒng)，當其缺損直徑>3mm時無法自身修復，目前臨床主要治療方法均存在或多或少的缺陷。近年來快速發(fā)展的組織工程技術(shù)，為關(guān)節(jié)軟骨缺損的再生修復治療提供了新思路和新方法。
　　 關(guān)節(jié)軟骨組織工程技術(shù)主要由支架材料制備、種子細胞獲取及體外組織構(gòu)建三部分組

2、成。理想的關(guān)節(jié)軟骨組織工程支架材料應具備：①良好的生物相容性，支架本身和支架降解所產(chǎn)生的物質(zhì)不引起毒性反應；②適度的生物降解性，降解速度和軟骨再生的速度相匹配；③具有足夠的力學強度；④具有一定的孔隙和孔徑，且孔隙率達到90％以上、孔徑為100-300μm，以利于細胞的黏附和生長；⑤良好的生物活性。目前應用的支架材料主要包括：①天然材料，如膠原蛋白、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等；②
　　 人工合成材料，如聚乳酸、聚乙烯醇等。應用這些支架

3、材料修復關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果，距離臨床要求仍有一定差距，其主要原因包括：①應用的材料生物活性不足，②支架材料的組織相容性不好，③新生組織不能與原組織很好的接合，④支架降解速度與組織再生速度不相當?shù)取?br>　　 本研究依據(jù)材料學仿生和復合原理，在完成豬Ⅱ型膠原蛋白海綿支架的制備及其相關(guān)性能檢測基礎(chǔ)上，應用天然關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的主要成分：Ⅱ型膠原蛋白（CollagenⅡ，ColⅡ）、硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，C

4、S）、透明質(zhì)酸（hyaluronanHA），并復合具有良好力學強度、生物相容性與可降解性的人工合成聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）制備關(guān)節(jié)軟骨組織工程ColⅡ-CS-HA-PVA 仿生支架。通過對所構(gòu)建的ColⅡ-CS-HA-PVA 復合支架相關(guān)的理化檢測、細胞與支架復合后體外共培養(yǎng)、兔背部皮下埋植實驗，證實所構(gòu)建的ColⅡ-CS-HA-PVA 復合支架在力學方面有明顯的提高，并且對細胞無毒副作用，具有良好的組織相

5、容性。
　　 第一部分豬Ⅱ型膠原蛋白海綿支架的制備本部分研究為了更好的修復關(guān)節(jié)軟骨缺損，依據(jù)材料仿生原理，提取正常成年豬膝關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)中主要成分Ⅱ型膠原蛋白（ColⅡ），應用所提取的ColⅡ為材料應用真空凍干技術(shù)來制備海綿支架，并對所制備的海綿支架理化性能進行相關(guān)檢測。
　　 一、實驗方法
　　 1．參照本實驗室建立的ColⅡ的提取方法，從豬膝關(guān)節(jié)透明軟骨中提取ColⅡ，應用真空凍干方法來制備膠原蛋白海綿支

6、架；
　　 2．海綿支架理化性能相關(guān)檢測（1）組織切片染色和掃描電鏡觀察觀察海綿支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
　　 （2）支架生物力學測試；
　　 （3）體外降解實驗評價所構(gòu)建的海綿支架降解速度；
　　 （4）支架-細胞共培養(yǎng)，檢測海綿支架細胞相容性；
　　 3．數(shù)據(jù)應用SPSS13.0.軟件進行分析。
　　 二、實驗結(jié)果
　　 1．構(gòu)建的膠原海綿支架具備良好的孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙率可以達到約90％

7、，組織學染色觀察支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，各孔之間彼此聯(lián)通，且有良好的孔通率；
　　 2．對支架進行生物力學測試發(fā)現(xiàn)所能承受的最大拉力為0.33N；
　　 3．通過降解實驗發(fā)現(xiàn)，提高膠原蛋白濃度所構(gòu)建的支架降解速度有所減慢，經(jīng)EDC 改性后，降解速度較改性前也有明顯減慢（p<0.05）；
　　 4．發(fā)現(xiàn)種子細胞在所構(gòu)建的海綿支架上黏附良好，并且在支架的孔壁上生長旺盛，細胞形態(tài)良好；
　　 三、結(jié)論
　

8、　 通過本實驗方法可以構(gòu)建出膠原海綿支架，對支架掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的海綿支架具有良好的孔徑和孔隙率；組織化學染色觀察，發(fā)現(xiàn)海綿支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，各孔之間彼此相通，細胞接種實驗和兔背部皮下埋植實驗證實所構(gòu)建的海綿支架具有良好的組織相容性，可以為種子細胞提供一個良好的、安全的生長場所。但通相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)，此支架存有如下問題：1.與天然軟骨細胞外基質(zhì)主要成分相比材料還不夠仿生；2.力學強度還不夠滿意。因此，在第二部分實驗中在材料和

9、強度方面加以改進。
　　 第二部分 ColⅡ-CS-HA-PVA 軟骨仿生支架的構(gòu)建針對上一部分實驗所構(gòu)建支架存在的不足，本部分在Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）中添加硫酸軟骨素（CS）和透明質(zhì)酸（HA）來構(gòu)建仿生支架，通過添加高分子聚合物聚乙烯醇（PVA）的方法來提高膠原蛋白支架的力學性能，并對改進后所構(gòu)建的復合支架相關(guān)理化性能進行檢測分析。
　　 一、實驗方法
　　 1．應用提取的Ⅱ型膠原蛋白（COLⅡ）、硫酸軟骨素

10、（CS）、透明質(zhì)酸（HA）
　　 和高分子聚合物聚乙烯醇（PVA）使用冷凍干燥等技術(shù)來構(gòu)建組織工程復合支架；
　　 2．復合支架理化性能相關(guān)檢測（1）組織化學染色和掃描電鏡觀察支架的形態(tài)結(jié)構(gòu)；
　　 （2）力學測試檢驗支架的力學強度；
　　 （3）支架-細胞共培養(yǎng)，檢測海綿支架細胞相容性；
　　 （4）兔背部皮下埋植實驗，檢測支架組織相容性；
　　 3．數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計

11、分析。
　　 二、實驗結(jié)果
　　 1．掃面電鏡觀察，ColⅡ-HA-CS-PVA 復合支架孔隙均勻，孔隙率可以達到約93％，組織學染色觀察支架呈現(xiàn)出良好的，且彼此聯(lián)通的孔隙結(jié)構(gòu)，且有良好的孔通率；
　　 2．經(jīng)力學測試，ColⅡ-HA-CS-PVA 復合支架最大張力約為1.19N，單純ColⅡ
　　 -HA-CS 復合支架約為0.55N，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.985，P=0.002）；
　　

12、3．支架-細胞共培養(yǎng)，組織學HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)細胞在支架的孔壁上粘附并且生長旺盛，細胞形態(tài)良好；
　　 4．兔背部皮下埋植實驗，組織切片染色觀察證實，植入支架材料具有良好的組織相容性。
　　 三、結(jié)論
　　 對所構(gòu)建ColⅡ-HA-CS-PVA 復合支架通過掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)；組織化學染色觀察，可以看到海綿支架孔隙結(jié)構(gòu)良好，彼此相通；在支架上接種細胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)具備良好的細胞相容性，可為種

13、子細胞增殖和分化提供一個適宜的三維環(huán)境；兔背部皮下埋植實驗證實所構(gòu)建的海綿支架具有良好的組織相容性。
　　 全文結(jié)論
　　 本研究所構(gòu)建的ColⅡ-HA-CS-PVA 復合支架具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，在材料上也更加仿生，添加PVA后有效彌補了單純應用ColⅡ為材料所構(gòu)建的支架強度不夠的問題，通過支架-細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，支架具有良好的細胞相容性；兔背部皮下埋植實驗證實支架具有良好的組織相容性，下一步準備進行大樣本量動物關(guān)節(jié)軟骨缺