鈣信號(hào)通路相關(guān)基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)不同發(fā)育階段的表達(dá)及其與吡喹酮體外作用的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：研究細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)鈣信號(hào)通路基因的家族成員（CamKII、Cavβ1）在蟲(chóng)體發(fā)育的各個(gè)階段（棘球蚴生發(fā)層、原頭蚴及成蟲(chóng)）基因表達(dá)的差異，同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)研究吡喹酮（PZQ）體外干預(yù)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)后兩基因的表達(dá)情況，推測(cè)PZQ的作用靶點(diǎn)。
　　方法：分別從細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)、原頭蚴以及棘球蚴生發(fā)層中提取總RNA，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)Ca

2、mKII基因序列及Cavβ1基因序列設(shè)計(jì)跨越內(nèi)含子的基因特異性引物，用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，選用β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)由質(zhì)粒DNA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對(duì)CamKII基因及Cavβ1基因進(jìn)行定量分析；通過(guò)從人工感染30天的比格犬的小腸中獲得細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)，體外短暫培養(yǎng)后留作實(shí)驗(yàn)用，以3天為干預(yù)周期，原頭蚴及包囊為對(duì)照組，以不同濃度的為PZQ體外干預(yù)濃度，掃描電鏡（SEM）與透射電鏡（TEM）觀察PZQ干預(yù)成

3、蟲(chóng)后體表結(jié)構(gòu)以及超微結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí)，收集各濃度組的成蟲(chóng)樣本進(jìn)行總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)鈣信號(hào)通路基因的家族成員（CamKII、Cavβ1）在PZQ干預(yù)后的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果：成功建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和Real-time PCR技術(shù)對(duì)鈣信號(hào)通路基因的家族成員（CamKII、Cavβ1）階段性表達(dá)的定量分析方法；分析結(jié)果顯示CamKII基因及Cavβ1基因均在成蟲(chóng)階段高表達(dá)，CamKII基因在成蟲(chóng)

4、中的表達(dá)量是包囊生發(fā)層的20295倍，在原頭蚴的表達(dá)量是包囊生發(fā)層的1152倍；Cavβ1在成蟲(chóng)的表達(dá)量是包囊生發(fā)層的5526倍，在原頭蚴的表達(dá)量是包囊生發(fā)層的636倍。兩基因的相對(duì)表達(dá)量SQ/Actin分別為13.4和1.9。PZQ體外系列濃度干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，PZQ對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)具有很強(qiáng)的殺傷作用，SEM結(jié)果顯示PZQ使蟲(chóng)體的體表空泡變性，蟲(chóng)體結(jié)構(gòu)不完整；TEM結(jié)果顯示PZQ引起成蟲(chóng)皮層結(jié)構(gòu)消失，出現(xiàn)大量空洞等現(xiàn)象。體外干預(yù)后的基

5、因檢測(cè)結(jié)果顯示，CamKII基因及Cavβ1基因的表達(dá)量均隨著濃度的升高未呈現(xiàn)出明顯的變化的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：PZQ具有體外抗細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的作用，并且與劑量、時(shí)間呈現(xiàn)依賴(lài)性關(guān)系。同時(shí)，PZQ僅對(duì)成蟲(chóng)具有明顯的殺傷效果，而對(duì)原頭蚴以及囊泡的作用效果不明顯。qRT-PCR基因檢測(cè)結(jié)果顯示，鈣信號(hào)通路基因的家族成員（CamKII、Cavβ1）在蟲(chóng)體發(fā)育的成蟲(chóng)階段的表達(dá)與原頭蚴及囊泡階段的表達(dá)相比具有明顯的差異，但在PZQ體外干預(yù)成蟲(chóng)