芽孢桿菌PCR鑒定方法的建立和應(yīng)用.pdf

1、準(zhǔn)確快速鑒定產(chǎn)品中的微生物種類是保障微生物肥料安全和有效的前提.傳統(tǒng)的鑒定方法存在一些不足的地方,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,有時(shí)又準(zhǔn)確度不高,分子鑒定方法是解決微生物肥料質(zhì)量檢測(cè)中菌種判定難、效率低的有效途徑,但目前應(yīng)用仍較少.本文根據(jù)種特異性基因序列設(shè)計(jì)引物,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)建立一套簡(jiǎn)單、快速鑒定7種常見芽孢桿菌的方法,從而為微生物肥料產(chǎn)品的質(zhì)量和安全性檢驗(yàn)提供技術(shù)支持. 1.通過(guò)基因序列的同源性分析,篩選出具有種(群)特異性的基

2、因作為PCR的靶序列.利用軟件設(shè)計(jì)了枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌 (B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌 (B.licheniformis)、短小芽孢桿菌 (B.pumilus)、巨大芽孢桿菌 (B.megaterium)、蠟樣群芽孢桿菌 (B.cereus group)、膠胨樣群芽孢桿菌 (B.mucilaginosus group) 的引物,通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)比較分析得到 7 對(duì)具有

3、種群特異性的引物.設(shè)計(jì)篩選的引物分別是:根據(jù) rpoA 基因設(shè)計(jì)了引物B.subtilis BSL72/ BSR328,依據(jù) gyrA 基因設(shè)計(jì)了引物 B.amyloliquefaciens L100/R836 和 B.licheniformis L168/R514,在 spoOA 基因的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的引物 B.megaterium BML257/BMR700和引物 B.cereus group L214/625,根據(jù) 16S rRNA

4、基因設(shè)計(jì)了引物 B.mucilaginosus group L415/R1008和引物 B.pumilus L354/R674. 2. 采用設(shè)計(jì)的種特異引物,通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)的退火溫度、引物濃度、Mg<'+>濃度等關(guān)鍵因子,分別建立了不同種(群)的特異PCR反應(yīng)體系.經(jīng)過(guò)3個(gè)屬15個(gè)種的模式菌株和(或)標(biāo)準(zhǔn)菌株(共41株)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,每個(gè)反應(yīng)體系在種(群)內(nèi)均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶,而與其他種群中無(wú)交叉反應(yīng)(僅短小芽孢桿菌和巨大芽孢

5、桿菌引物與部分菌株有陽(yáng)性反應(yīng)),顯示了良好的特異性.在靈敏度測(cè)試中,每個(gè)反應(yīng)體系至少能檢測(cè)到100 pg濃度的基因組DNA,而枯草芽孢桿菌和膠胨樣群芽孢桿菌的敏感性達(dá)到了10pg,較高的靈敏度滿足PCR鑒定和檢測(cè)菌種的要求,微生物含量較低的樣品中也能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶.PCR技術(shù)鑒定不僅可以準(zhǔn)確鑒定不同種(群)的菌株,而且還能重新界定菌株的歸屬,在本文中將參考菌株CGMCC1.15、1.108、1.354 從枯草芽孢桿菌中歸類至解淀粉芽孢桿

6、菌. 3. 在單重PCR基礎(chǔ)上分別建立了枯草群復(fù)合PCR反應(yīng)體系(含四對(duì)引物)和巨大/蠟樣群復(fù)合PCR體系(含兩對(duì)引物),其中枯草群復(fù)合PCR反應(yīng)可同時(shí)鑒定或鑒別枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌,巨大芽孢桿菌和蠟樣群芽孢桿菌的復(fù)合PCR反應(yīng)可同時(shí)鑒定或鑒別巨大芽孢桿菌和蠟樣群芽孢桿菌.經(jīng)過(guò)3個(gè)屬15個(gè)種的模式菌株和(或)標(biāo)準(zhǔn)菌株特異性驗(yàn)證,復(fù)合PCR.反應(yīng)具有良好的特異性和敏感性,與單重PCR特異性一致,

7、只是靈敏度有所下降(約一個(gè)數(shù)量級(jí)),在100～1000 pg范圍內(nèi),在大量、快速鑒定和鑒別枯草群和巨大/蠟樣群芽孢桿菌中具有重要意義. 4. 對(duì)產(chǎn)品中23株枯草群菌株、10株巨大芽孢桿菌和蠟樣群芽孢桿菌、10株疑似膠胨樣群芽孢桿菌的基因組:DNA進(jìn)行的PCR擴(kuò)增結(jié)果和典型生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:所有枯草群菌株均有擴(kuò)增產(chǎn)物,依據(jù)產(chǎn)物大小判斷的菌株分類地位與生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,巨大和蠟樣群菌株亦是如此;疑似膠胨樣群菌株中有擴(kuò)增產(chǎn)物的菌株表現(xiàn)

8、典型的培養(yǎng)特征和菌體特征,而非膠胨樣群菌株則無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物,在菌落或菌體方面與其存在顯著差異.因此特異PCR技術(shù)用于鑒定生產(chǎn)菌種準(zhǔn)確可靠,具有良好的應(yīng)用價(jià)值. 5. 通過(guò)產(chǎn)品特征的分析和研究,建立了產(chǎn)品洗滌、菌體懸浮、珠式破碎、酚-氯仿-異丙醇抽提的微生物肥料產(chǎn)品DNA提取方法,解決了微生物肥料中腐植質(zhì)含量高難去除和芽孢難破壁的DNA提取難題.使用該方法獲得的樣品DNA為無(wú)色或淺棕色,大小約9Kb,經(jīng)過(guò)PcR擴(kuò)增,液體樣品的PCR靈

9、敏性達(dá)到10<'4>-10<'5>CFU/mL,固體草炭樣品靈敏度達(dá)到10<'7>CFU/0.2g.雖然該方法DNA損失較多,敏感性稍差,但是成本低,效率高,可直接用于PCR,為PCR方法直接檢測(cè)產(chǎn) 6. 利用以上DNA提取技術(shù)獲得16個(gè)微生物肥料產(chǎn)品的DNA,經(jīng)過(guò)特異PCR擴(kuò)增,除了兩個(gè)產(chǎn)品中一種目標(biāo)微生物含量太低(低于檢測(cè)限)無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物外,其他產(chǎn)品均有目標(biāo)菌的擴(kuò)增產(chǎn)物,根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小對(duì)產(chǎn)品的鑒定與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及生化鑒定結(jié)

10、果一致,而且PCR反應(yīng)的特異性沒有受到產(chǎn)品中其他微生物的干擾.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本文建立的種(群)特異PCR技術(shù)和DNA提取方法可用于微生物肥料產(chǎn)品的直接檢測(cè),在提高微生物肥料的檢測(cè)水平和檢測(cè)效率方面有著巨大的應(yīng)用潛力. 通過(guò)大量參考菌株和生產(chǎn)菌株以及微生物肥料產(chǎn)品的試驗(yàn)表明:基于序列分析和種(群)特異引物的基礎(chǔ)上建立的單重PCR和復(fù)合PCR方法,在鑒定和鑒別7個(gè)種(群)的芽孢桿菌菌株上具有快速、準(zhǔn)確、敏感的優(yōu)點(diǎn),該方法不僅能夠用于純