神經(jīng)肽P物質(zhì)活化NK92-MI細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境及生理功能平衡和穩(wěn)定過程中具有重要作用。神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、激素等可通過與免疫細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。神經(jīng)肽P物質(zhì)(SP)是發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽之一，廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)及組織器官。SP不僅是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，而且還是神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)共同的調(diào)節(jié)因子，是傳遞信息、調(diào)節(jié)機(jī)體反應(yīng)的重要信使。SP的功能主要通過NK-1R介導(dǎo)，NK-1R在NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞

2、等均有表達(dá)。
　　 NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，殺傷靶細(xì)胞不需抗原預(yù)先致敏，無MHC限制性，其功能的發(fā)揮主要依賴于其識(shí)別靶細(xì)胞的受體。NK細(xì)胞能通過早期分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子來調(diào)節(jié)獲得性免疫，是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁。
　　 目前，有關(guān)SP對(duì)NK細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。已有一些研究（包括本課題組的研究）表明SP對(duì)NK細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用，但其作用機(jī)制尚不十分清楚，特別是SP活化NK細(xì)胞的

3、信號(hào)通路未見報(bào)道，其活化過程中變化的蛋白分子也報(bào)道較少。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的科學(xué)，可對(duì)不同時(shí)間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體進(jìn)行研究。通過比較分析不同條件下蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，來發(fā)現(xiàn)和鑒定出有差異的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)群。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為全面研究細(xì)胞蛋白質(zhì)變化提供了條件。
　　 NK-1R屬G-蛋白偶聯(lián)受體家族，受體激活后通過G-蛋白調(diào)節(jié)第二信使的形成。我們采用Real

4、-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別測(cè)定了SP對(duì)NK-1R基因表達(dá)和膜受體表達(dá)的影響，結(jié)果顯示SP可誘導(dǎo)NK-1R的表達(dá)明顯增高，說明SP通過增加NK-1R的表達(dá)來放大其對(duì)NK92-MI細(xì)胞的各種調(diào)節(jié)作用，提示SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞的各種調(diào)節(jié)作用應(yīng)為SP激活NK-1R后的下游事件。因此有必要進(jìn)一步研究SP對(duì)與G蛋白影響。
　　 G蛋白屬外周蛋白，它們?cè)谀さ募?xì)胞質(zhì)面通過脂肪酸鏈錨定在質(zhì)膜上。G蛋白由α、β、γ三個(gè)亞基組成，Gα亞基

5、在信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。G蛋白是一個(gè)大家族，分為Gs，Gi/o，Gq/11和G124個(gè)家族。依細(xì)胞類型的不同，SP可通過不同的G蛋白產(chǎn)生不同的第二信使而發(fā)揮作用。
　　 根據(jù)對(duì)腺苷酸環(huán)化酶(AC)的作用，G蛋白可分為刺激性G蛋白(Gs)和抑制性G蛋白(Gi)。Gs的主要作用是激活A(yù)C和鈣離子通道，Gi的主要作用是抑制AC和激活鉀離子通道。細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)量與AC的活性密切相關(guān)，AC被激活后促進(jìn)cAMP的合成。cAMP作為

6、第二信使激活依賴cAMP的蛋白激酶A(PKA)實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)功能，參與細(xì)胞代謝過程的調(diào)節(jié)。cAMP-PKA信號(hào)通路是否參與SP活化NK細(xì)胞的過程尚無報(bào)道。
　　 本研究制備了SP活化的NK92-MI細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白的雙向凝膠圖譜，應(yīng)用PDQuest軟件對(duì)雙向凝膠電泳圖譜進(jìn)行比較分析，找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，再采用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定全部差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。擬獲得SP激活NK

7、92-MI細(xì)胞前后的差異表達(dá)蛋白譜。
　　 通過QRT-PCR和westernblot技術(shù)分別檢測(cè)SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞Gαs和Gαi3mRNA和蛋白表達(dá)的影響。采用Gs特異性拮抗劑NF449分析Gs在SP調(diào)節(jié)NK92-MI細(xì)胞功能中的作用。通過檢測(cè)NF449對(duì)SP活化NK92-MI細(xì)胞活性及相關(guān)分子的影響來探討SP調(diào)控NK92-MI細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而闡明SP調(diào)控NK細(xì)胞功能的分子機(jī)制。
　　 材料和方法：

8、>　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 NK細(xì)胞株:NK92-MI細(xì)胞株用含12.5％胎牛血清和12.5％馬血清的α-MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
　　 2.SP活化NK細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 制備了SP活化的NK92-MI細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞總蛋白的雙向凝膠圖譜，應(yīng)用PDQuest軟件對(duì)雙向凝膠電泳圖譜進(jìn)行比較分析，找出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，再采用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定全部差異

9、表達(dá)的蛋白質(zhì)。
　　 3.SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞Gαs和Gαi3表達(dá)的影響
　　 通過QRT-PCR和western blot技術(shù)分別檢測(cè)SP對(duì)NK92-MI細(xì)胞Gαs和Gαi3mRNA和蛋白表達(dá)的影響。
　　 4.NF449對(duì)SP活化的NK92-MI細(xì)胞殺傷活性、增殖活性的影響
　　 NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞用Gs拮抗劑NF449預(yù)先作用30min，無NF449預(yù)處理組用相同體積PBS作用

10、，再以濃度為10-12 M的SP作用24h（殺傷試驗(yàn)）或48h（增殖試驗(yàn)），用CCK-8試劑盒檢測(cè)NF449對(duì)SP活化的NK細(xì)胞殺傷活性和增殖活性的影響。
　　 5.NF449對(duì)SP活化的NK92-MI細(xì)胞與殺傷活性相關(guān)的蛋白和基因表達(dá)的影響NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞用Gs拮抗劑NF449預(yù)先作用30min，無NF449預(yù)處理組用相同體積PBS作用，再以濃度為10-12M的SP作用24h。提取細(xì)胞總蛋白和RNA，分別用

11、Real-Time PCR和Western-Blot技術(shù)檢測(cè)NF449對(duì)SP活化的NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶B mRNA和蛋白表達(dá)的影響;用Real-Time PCR檢測(cè)NF449對(duì)SP活化的NK92-MI細(xì)胞IFN-γ mRNA表達(dá)的影響;分別用Real-Time PCR和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)NF449對(duì)SP活化的NK92-MI細(xì)胞NKp46、NKp44、NKp30 mRNA及膜受體的表達(dá)的影響。
　　 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

12、>　　 所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±SD）表示，各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-way ANOVA)，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)手段分析了SP活化的NK92-MI細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的蛋白質(zhì)差異，共找出40個(gè)差異蛋白點(diǎn)，鑒定出Rho GDI等21種蛋白質(zhì)。通過GO進(jìn)行功能分類，這些蛋白具有抗凋亡、參與免疫應(yīng)答、參與應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞

13、生長(zhǎng)和參與信號(hào)傳導(dǎo)等功能。
　　 2.濃度為10-12、10-10M的SP均可促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞Gαs和Gαi3 mRNA表達(dá)，與對(duì)照組比較有明顯差異。濃度為10-14、10-12、10-10M的SP均可促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞Gαs蛋白表達(dá)，與對(duì)照組比較有明顯差異;濃度為10-12、10-10M的SP對(duì)Gαi3的表達(dá)有促進(jìn)作用，與對(duì)照組比較有明顯差異。
　　 3.結(jié)果顯示濃度為10-12M的SP能夠促進(jìn)無NF449預(yù)

14、處理組細(xì)胞殺傷活性，但對(duì)NF449預(yù)處理組細(xì)胞則無明顯促進(jìn)殺傷活性作用。且在此濃度SP作用下，無NF449預(yù)處理組細(xì)胞殺傷活性明顯高于NF449預(yù)處理組細(xì)胞。這表明NF449對(duì)SP的促殺傷活性具有阻斷作用。
　　 4.濃度為10-12M的SP對(duì)無NF449預(yù)處理組和NF449預(yù)處理組細(xì)胞均有促進(jìn)增殖活性作用;在此濃度的SP作用下，兩組細(xì)胞的增殖活性無明顯差異。結(jié)果表明，NF449對(duì)SP的促增殖活性無明顯影響。
　　 5.

15、濃度為10-12M的SP能夠明顯促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞穿孔素和顆粒酶mRNA和蛋白表達(dá)水平，但NF449對(duì)這種促進(jìn)作用有明顯的阻斷作用。進(jìn)而表明SP可通過促進(jìn)Gs的表達(dá)促進(jìn)穿孔素和顆粒酶的表達(dá)，從而促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性。
　　 6.濃度為10-12M的SP對(duì)無NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞IFN-γ mRNA的表達(dá)有促進(jìn)作用，但對(duì)NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞IFN-γ mRNA的表達(dá)無明顯促進(jìn)作用。結(jié)果

16、表明SP可通過促進(jìn)Gs的表達(dá)上調(diào)IFN-γ mRNA的表達(dá)，這也可能與SP促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞的殺傷活性有關(guān)。
　　 7.濃度為10-12 M的SP對(duì)無NF449預(yù)處理組和NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞NKp44、NKp30 mRNA的表達(dá)均有促進(jìn)作用。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示濃度為10-12M的SP對(duì)無NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞NKp44的表達(dá)有促進(jìn)作用，但對(duì)NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞無明顯促進(jìn)作用，在

17、此濃度的SP作用下，無NF449預(yù)處理組細(xì)胞NKp44的表達(dá)水平明顯高于NF449頇處理組細(xì)胞;濃度為10-12M的SP對(duì)無NF449預(yù)處理組和NF449預(yù)處理組NK92-MI細(xì)胞的NKp30表達(dá)均無明顯影響。結(jié)果表明NF449對(duì)SP促進(jìn)NKp44表達(dá)的活性具有一定的阻斷作用，也進(jìn)一步表明NF449對(duì)SP活化NK92-MI細(xì)胞殺傷活性的阻斷作用與NF449對(duì)NKp44表達(dá)的阻斷作用有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Rho

18、GDI蛋白可能與SP活化NK92-MI細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過程有關(guān)。
　　 2.SP可促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞Gαs和Gαi3 mRNA及蛋白的表達(dá)，表明SP對(duì)cAMP-PKA通路有調(diào)控作用
　　 3.NF449對(duì)SP的促殺傷活性具有一定的抑制作用;NF449對(duì)SP的促增殖活性無明顯影響。表明SP可通過促進(jìn)Gs表達(dá)促進(jìn)NK92-MI細(xì)胞殺傷活性。
　　 4.NF449對(duì)SP促進(jìn)穿孔素、顆粒酶、NKp44分子表達(dá)的活性具有