鹽藻鈉磷共轉(zhuǎn)運(yùn)通道基因家族的克隆與分析.pdf

1、磷是所有生物必需的生命元素，是生物體維持其基本生物學(xué)功能的關(guān)鍵物質(zhì)。外界無機(jī)磷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)依賴于細(xì)胞膜上磷轉(zhuǎn)運(yùn)通道的轉(zhuǎn)運(yùn)，這是生物利用磷的第一步。鹽藻(Dunaliella viridis)作為一種具有高度抗鹽的模式生物被廣泛的研究和利用，而鹽藻中的無機(jī)磷可能是啟動(dòng)鹽藻耐鹽機(jī)制的“開關(guān)”，并且之前的研究指出在鹽藻的基因組中可能存在一個(gè)龐大的無機(jī)磷通道基因家族。因此，對(duì)鹽藻無機(jī)磷通道基因家族的研究，不僅能夠進(jìn)一步了解鹽藻的耐鹽機(jī)制的啟動(dòng)機(jī)理

2、，而且可以為我們初步探究鹽藻中的基因復(fù)制機(jī)制提供線索。 本實(shí)驗(yàn)室利用SSH技術(shù)從鹽藻(Dunaliella viridis)中分離到受高鹽和磷“饑餓”誘導(dǎo)的鈉磷共轉(zhuǎn)運(yùn)通道基因DvSPT1和DvSPT2，并且將鈉磷共轉(zhuǎn)運(yùn)通道基因與CrGFP融合，電擊轉(zhuǎn)化萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察確定它們定位于葉綠體的膜上。為了更好的研究 DvSPT1和DvSPT2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，我們想

3、得到這兩個(gè)基因5’上游的更多序列，所以根據(jù)這兩個(gè)基因的編碼區(qū)段設(shè)計(jì)了引物，利用PCR四維篩選體系在鹽藻BAC文庫中篩選得到對(duì)應(yīng)的陽性BAC克隆。通過“鳥槍”法測(cè)序得到了兩段包含DvSPT1和DvSPT2基因的鹽藻基因組片段，大小分別是65kb和72kb。我們從中不但分離到 DvSPT1和DvSPT2的全長基因組序列，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了與 DvSPT1高度同源的基因家族新成員，我們將其命名為DvSPT1;2。 在DvSPT1 BAC D

4、NA序列中，大片段重復(fù)序列覆蓋了DvSPT1和DvSP7T1;2的5’-上游區(qū)域以及整個(gè)編碼區(qū)，但不包括3’-下游區(qū)域。DvSPT1 和 DvSPT1;2的ORF非常相似(99.7％的同源性)，只有7個(gè)同義突變的堿基，它們的氨基酸序列則完全相同。DvSPT1和DvSPT1;2的基因組序列重復(fù)區(qū)段有97.9％的同源性，同義突變率Ks=0.01<0.02，這是一個(gè)尚處在早期階段的基因復(fù)制事件。Real-timePCR分析顯示，在6個(gè)不同鹽穩(wěn)

5、態(tài)條件下DvSPT1和DvSPT1;2的表達(dá)發(fā)生了分化，這可能是由于它們5’-上游調(diào)控區(qū)域的序列分化與3’-下游區(qū)域(3’-UTR)的序列交換導(dǎo)致的。而對(duì)于高鹽和磷“饑餓”脅迫，DvSPT1;2同樣受到誘導(dǎo)，并且趨勢(shì)與DvSPT1和 DvSPT2類似，說明其功能尚未發(fā)生分化，只是增加了鹽藻對(duì)于更寬鹽濃度的適應(yīng)性。此外，我們得到的兩個(gè)65kb和72kb的鹽藻基因組片段是研究鹽藻基因組序列的良好材料，對(duì)于它們的分析并結(jié)合GenBank中其它

6、鹽藻基因組序列，我們歸納出鹽藻基因組序列的一些重要特征：鹽藻基因組序列與GenBank上已知的其它物種序列的同源性非常低；平均GC含量為52％左右，比同為模式生物的萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的GC含量(65.7％)要低的多；序列中存在大量的微衛(wèi)星序列，而其中尤以二堿基的(CA)<,n>/(TG)<,n>型重復(fù)序列最為多見；鹽藻基因組序列中的大片段重復(fù)序列可以幫助鹽藻在進(jìn)化中增加基因的數(shù)量，分化基因的功