皺邊石杉種質(zhì)資源SSR多態(tài)性分析、PS-ID驗證與其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、石杉堿甲(Huperzine A，HupA)是治療早老性癡呆(又稱阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD))的重要藥物來源。HupA主要存在于石杉科及石松科植物中,含量僅為萬分之幾至千分之幾。這些植物大多生長緩慢,對生存環(huán)境要求苛刻。尋找新的生物資源,運用有效的生物技術(shù)手段,為生產(chǎn)足量、低成本的HupA臨床用藥做一些基礎(chǔ)應(yīng)用研究工作,已成為當務(wù)之急。對石杉科植物HupA的潛在資源調(diào)查獲知,湖南分布為新記錄,大多集中在

2、原始次生林。如何通過生物化學(xué)的途徑提高現(xiàn)有石杉科植物HupA的含量,國內(nèi)外還未見其相關(guān)研究報道。
　　我們對中、日兩國采集得到的8個點、40個皺邊石杉樣本進行其PS-ID分析,從分子水平證實其為石杉科植物,與Huperzia lucidula高度同源:與目前用于HupA天然資源獲取的蛇足石杉對比分析其HupA含量,皺邊石杉為HupA含量較高的優(yōu)異資源;探索皺邊石杉的組織培養(yǎng)體系,從其組培材料及新鮮植株當中篩選了具有生產(chǎn)HupA潛力

3、的4株內(nèi)生菌,1株高產(chǎn)四草酸鉀的黑曲霉。為后續(xù)進行HupA的生物發(fā)酵培養(yǎng)提供了可供改造的微生物材料,可望從微生物途徑獲得HupA純天然產(chǎn)物;利用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)四草酸鉀,可望改變傳統(tǒng)的、化學(xué)合成方法,以生物發(fā)酵的形式得到高產(chǎn)率、無污染的純品。
　　第一章，皺邊石杉種質(zhì)資源SSR多態(tài)性及其PS-ID類型身份分析為研究收集獲得的中、日兩國8個點、40個皺邊石杉樣本的SSR基因型多態(tài)性及其PS-ID序列,以Paul G. Wolf等對Hu

4、perzia lucidula (Lycopodiaceae)葉綠體全基因組的克隆序列,設(shè)計13對SSR引物進行PCR擴增,結(jié)果表明:只有P2的第一個樣本在HCtSSR6引物的擴增下出現(xiàn)了變異,其它均未發(fā)現(xiàn)帶型的分離;采用PS-ID通用引物,擴增rpl 16-rpl 14間隔區(qū)的核苷酸序列,獲得了中日皺邊石杉植物的PS-ID序列:t aaaattttat ataaatataa atgcaatgtt tttcactatg aaataatt

5、aataataattaa atatttaaaa tagatagatt aacctattct aatttttcct tacaaaaccccccaaaaata aagattttta gggggaatat catttctcta atctaaataa ataaat o與Paul G. Wolf等驗證的Huperzia lucidula植物的PS-ID序列完全一致。由此獲知,我們收集到的中、日兩國部分皺邊石杉資源與Huperzia lucidul

6、a植物高度同源,均屬于同一個科的植物,是值得研究的新的石杉科植物資源。
　　第二章，HPLC法定量研究皺邊石杉中HupA的含量為對比研究與目前用于HupA天然資源獲取的蛇足石杉進行比較,建立了皺邊石杉中HupA含量的HPLC系統(tǒng)分析方法,并對不同來源的皺邊石杉其HupA含量進行定量分析。結(jié)果表明:該方法的精密度、精確度、重現(xiàn)性均在HPLC方法學(xué)的范圍之內(nèi),10-12分鐘可以分離檢測一個樣品,實現(xiàn)了樣品檢測的高效率。運用該HPLC檢

7、測分析條件測定皺邊石杉中HupA含量,其葉、梗部位的HupA含量與其成熟度密切相關(guān),主要富集在地上部的幼嫩部位。不同小地域環(huán)境中皺邊石杉HupA含量與其遮蔭度密切相關(guān)。且HupA含量較蛇足石杉的高,尤其是其莖尖幼嫩部位,其含量最高達600.31μg/g是值得開發(fā)研究的又一新資源。
　　第三章，皺邊石杉內(nèi)生真菌的分離鑒定及相關(guān)代謝產(chǎn)物的初步研究為獲取天然的HupA藥物來源,從皺邊石杉新鮮材料及組織培養(yǎng)過程中第二次長菌高峰期的內(nèi)生菌中

8、,分離、純化了35個目標內(nèi)生真菌,對其篩選、發(fā)酵培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):3號、6號、4和7號組合具有生產(chǎn)HupA的潛力;14號菌具有合成四草酸鉀的高產(chǎn)能力。根據(jù)菌落形態(tài)及其菌絲體形態(tài)觀察,可初步推知:3號菌為叢梗孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)地霉屬(Geotrichum Lk.)的真菌;4號菌為曲霉目(Eurotiales)曲霉科(Eurotiaceae)草根霉屬(Thielavia Zopf)的真菌;6號菌為叢

9、梗孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)青霉屬(Penicillium Lk.ex Fr.)的真菌;7號菌為毛霉目(Mucorales)毛霉科(Mucoraceae)毛霉屬(Mucor Micheli)的真菌,14號菌為曲霉目(Eurotiale)曲霉科(Eurotiacea)黑曲霉屬(Aspergillus niger)的真菌。試驗中發(fā)現(xiàn)具有生產(chǎn)HupA潛力的內(nèi)生真菌,為后續(xù)進行HupA的生物發(fā)酵培養(yǎng)提供了可供