重組chi46在畢赤酵母中的表達(dá)及抗病原菌初步研究.pdf

1、球毛殼菌(Chaetomium globosum)是一種應(yīng)用前景廣闊的植物病害生物防治菌,含有很多優(yōu)良的生物防治基因,球毛殼菌46kD幾丁質(zhì)酶(chi46)就是其中之一。幾丁質(zhì)酶(chitinase Ec.3.2.14)能夠催化病原真菌細(xì)胞壁幾丁質(zhì)水解為幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖,廣泛存在于各種微生物、植物及動(dòng)物細(xì)胞和組織中,參與多種生理過(guò)程。幾丁質(zhì)酶在生物防治和幾丁質(zhì)資源的利用等方面具有巨大的應(yīng)用潛力,因而受到了廣泛的重視。為了利用

2、重組幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)廣譜抗性的生物農(nóng)藥,鑒于畢赤酵母(Pichia pastoris)易于培養(yǎng)、外源蛋白表達(dá)量高等特點(diǎn),故本研究采用畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)作為表達(dá)生產(chǎn)工具,從已構(gòu)建好的質(zhì)粒pGEX-chi中通過(guò)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出球毛殼菌chi46基因,將經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切的chi46基因和酵母表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行體外連接,構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體,經(jīng)過(guò)菌液PCR檢測(cè),雙酶切檢測(cè)并測(cè)序,得到有正確閱讀框的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-chi

3、6。將pPIC9-chi6和pPIC9空質(zhì)粒分別用限制性?xún)?nèi)切酶Stu I線性化后,采用電轉(zhuǎn)化的方法分別轉(zhuǎn)化GS115和KM71酵母感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)過(guò)甲醇利用表型的篩選和PCR檢測(cè)篩選得到2株高效利用甲醇GS115型和3株低效利用甲醇KM71型陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。通過(guò)檢測(cè)各轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清每隔24h的蛋白表達(dá)情況和酶活情況篩選出高效表達(dá)CHI46的工程菌株G6-5和K6-9。對(duì)兩株工程菌株分泌的重組CHI46粗酶液進(jìn)行了酶活測(cè)定與酶學(xué)特性研究,同時(shí)

4、對(duì)于重組CHI46的抑菌性進(jìn)行了初步摸索。發(fā)現(xiàn)GS115轉(zhuǎn)化子G6-5比KM71轉(zhuǎn)化子K6-9的產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)晚3d左右,產(chǎn)酶活力較后者高8.24%。重組CHI46在35℃-65℃的溫度范圍內(nèi),保持著相對(duì)穩(wěn)定的酶活性；重組CHI46亦有很廣的pH耐受范圍,在pH3-10有較穩(wěn)定的酶活力。這揭示出它生防領(lǐng)域中良好的應(yīng)用前景。確定酶系統(tǒng)發(fā)揮活性的最佳組合,即反應(yīng)體系Cu2+ 5mmol/L,溫度45℃,pH值5.0,依照該體系以N.O-羧甲基

5、殼聚糖為底物測(cè)得的重組CHI46發(fā)酵液酶活能達(dá)到30.19U。對(duì)不同底物的酶活測(cè)定結(jié)果表明,重組CHI46對(duì)于真菌細(xì)胞壁的酶活普遍較化合物高。重組CHI46粗酶液對(duì)立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、楊樹(shù)葉枯病菌(Alternaria alternata)、楊樹(shù)爛皮病菌(Cytospora chrysosperma)的生長(zhǎng)具有一定抑制作用,從而證明了重組CHI46具有降解病原真菌細(xì)胞壁的能力。幾丁質(zhì)酶的研究是一項(xiàng)具有重要