4-苯基丁酸對(duì)干細(xì)胞心肌分化的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　干細(xì)胞的心肌誘導(dǎo)分化是一個(gè)連續(xù)但分階段的過(guò)程，涉及內(nèi)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控程序和外源調(diào)節(jié)信號(hào)二者的協(xié)同。外源信號(hào)對(duì)心肌分化的影響，取決于細(xì)胞所處分化狀態(tài)，因而展現(xiàn)了明顯的階段特異性和劑量依賴性。在心肌多階段程序分化的進(jìn)程中，有多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與，包括TGF-β、Wnt、Notch和Hedgehog等。這些通路在細(xì)胞不同的分化階段，發(fā)揮了各自獨(dú)特的作用，影響了細(xì)胞在分化節(jié)點(diǎn)的命運(yùn)選擇。通過(guò)調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路，可引導(dǎo)細(xì)胞定向分化，制

2、備性質(zhì)均一、數(shù)量充沛的心肌細(xì)胞。一些小分子化合物對(duì)心肌分化的影響是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)之一。4-PBA是一種小分子化合物，可以作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿?。細(xì)胞在分化的過(guò)程中需要合成酶、抗體、血清蛋白以及細(xì)胞外基質(zhì)等成分，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中會(huì)負(fù)載大量的新合成蛋白質(zhì)。且干細(xì)胞在定向誘導(dǎo)心肌分化的過(guò)程中，前期需要懸浮培養(yǎng)形成擬胚體，擬胚體是一個(gè)三維球狀結(jié)構(gòu);到了中后期細(xì)胞需要貼壁培養(yǎng)，并迅速形成復(fù)層結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部細(xì)胞可能存在氧氣不足、能量

3、缺乏等情況，這些都可能會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的表觀遺傳調(diào)節(jié)是胚胎發(fā)育過(guò)程中基因激活或抑制的基礎(chǔ)，其在干細(xì)胞心肌分化過(guò)程具有重要作用。本課題想探究4-PBA作為一種小分子化合物，對(duì)心肌分化有什么影響，且是到底是哪種機(jī)制在起作用，能否通過(guò)減緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而促進(jìn)的分化，或者4-PBA是否是通過(guò)乙?；淖饔脕?lái)影響心肌的分化，為胚胎干細(xì)胞向心肌分化效率的提高提供方法，為獲得大量成熟、純凈且具有功能性的心肌細(xì)胞應(yīng)用于臨床提供希望。

4、　　內(nèi)容:
　　探究在胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的不同階段，加入4-PBA對(duì)心肌分化的影響，并深入分析4-PBA對(duì)胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的作用機(jī)制
　　方法:
　　1.以小鼠胚胎干細(xì)胞R1作為實(shí)驗(yàn)材料，用10-4MVC作為誘導(dǎo)劑，建立心肌分化模型。肉眼觀察跳動(dòng)擬胚體的數(shù)目，免疫熒光染色，觀察α-肌輔蛋白表達(dá)以及real-time PCR檢測(cè)不同時(shí)間段心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，確定分化模型是否建立成功。
　　2.在心肌

5、分化的不同階段收細(xì)胞提取RNA，real-time PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因以及乙?；揎椣嚓P(guān)基因的表達(dá)。
　　3.分不同時(shí)間段加入4-PBA，觀察對(duì)擬胚體跳動(dòng)數(shù)目的影響，初步確定4-PBA對(duì)心肌分化的影響。細(xì)化時(shí)間段，確定最佳加藥時(shí)間。在不同時(shí)階段的最佳加藥時(shí)間內(nèi)分別加入4-PBA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激動(dòng)劑衣霉素(TM)以及組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c(NaB)，對(duì)照組加入DMSO，觀察擬胚體跳動(dòng)的數(shù)目，real-time PCR檢

6、測(cè)不同階段心肌特異性標(biāo)志分子，western blotting檢測(cè)心肌特異性蛋白的表達(dá)。
　　4.轉(zhuǎn)染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因pRK-ATF4，real-time PCR檢測(cè)對(duì)心肌特異性標(biāo)志分子的影響。
　　結(jié)果:
　　1.心肌分化模型的建立
　　用10-4M VC做誘導(dǎo)劑，第1-5天在細(xì)菌培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，在懸浮培養(yǎng)的第三天就可以看到有擬胚體的形成，邊緣光滑且中央呈黑色，第5天后貼壁培養(yǎng)，在貼壁培養(yǎng)的第7-9天左右會(huì)

7、看到有自發(fā)跳動(dòng)的擬胚體，到貼壁培養(yǎng)的第7天跳動(dòng)擬胚體的數(shù)目達(dá)到峰值。選取誘導(dǎo)分化第12天的細(xì)胞胰酶消化，免疫熒光染色，可以發(fā)現(xiàn)心肌特異性α-肌輔蛋白表達(dá)，并且有明顯的肌小節(jié)結(jié)構(gòu)。選取誘導(dǎo)分化的第0、3、5、7、9、12天收細(xì)胞提取RNA，real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Nkx2.5與Gata4在誘導(dǎo)分化的第五天開始明顯升高。心肌細(xì)胞分化晚期特異收縮蛋白基因的表達(dá)Myl2、Myl7及Tnnt2在分化的第9天開始顯著上調(diào)(p＜0.01)。

8、表明心肌分化模型建立成功。
　　2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因以及乙?；揎椣嚓P(guān)基因的檢測(cè)
　　選取誘導(dǎo)分化的第0、3、5、7、9、12天收細(xì)胞提取RNA，real-time PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因以及乙?；揎椣嚓P(guān)基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)Bip、ATF4、Xbp1的表達(dá)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加先降低，再升高再降低，在第12天的時(shí)候顯著升高，CHOP的表達(dá)也是先降低再升高在第12天劇增。說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)存在明顯的階段性，由此初步

9、得出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了心肌的分化。乙?；揎椣嚓P(guān)基因Hadc2、4、6、7以及Cbp/P300的表達(dá)也具有明顯的階段性。
　　3.4-PBA對(duì)心肌分化的影響
　　Real-time PCR結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)存在明顯的階段性，而體外心肌細(xì)胞的分化過(guò)程分為三個(gè)階段，早期第(1-5)天、中期第(6-9)天、晚期第(10-12)天，所以在細(xì)胞分化的不同階段加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA(1M)，通過(guò)對(duì)擬胚體跳動(dòng)數(shù)目的

10、觀察初步確定，4-PBA對(duì)心肌分化的影響存在三個(gè)階段，早期促進(jìn)，中期抑制，晚期促進(jìn)。選取不同的時(shí)間點(diǎn)第1-2天、第3-5天、第1-5天加4-PBA收細(xì)胞提取RNA real-time PCR檢測(cè)Nkx2.5與Gata4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比在第1-2天時(shí)Nkx2.5與Gata4的表達(dá)升高最為顯著(p＜0.01)，在第6-7天、第8-9天、第6-9天、第10-11天、第11-12天、第10-12天加4-PBA收細(xì)胞提取RNA real-

11、time PCR檢測(cè)Myl2、Myl7及Tnnt2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在第6-7天的抑制作用最為顯著(p＜0.01)，在第11-12天的促進(jìn)作用最為顯著(p＜0.01)。確定最佳加藥時(shí)間。之后在第1-2天，第6-7天，第11-12天加4-PBA提取RNA real-time PCR檢測(cè)晚期基因Myl2和Myl7的表達(dá)，以及Western blotting檢測(cè)晚期蛋白MF20的變化，進(jìn)一步確定不同時(shí)間加4-PBA對(duì)心肌分化的影響，早期是促進(jìn)、中期

12、抑制、晚期又促進(jìn)，存在三個(gè)階段。
　　4.4-PBA對(duì)心肌分化作用機(jī)制的研究結(jié)果
　　(1)4-PBA對(duì)心肌分化的影響出現(xiàn)了三個(gè)階段的變化。在不同時(shí)間段加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激動(dòng)劑衣霉素（TM，0.025μg/ml）以及組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c(NaB，1M)，RNA real-time PCR檢測(cè)不同時(shí)間段對(duì)心肌特異性基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)衣霉素對(duì)心肌分化有明顯的促進(jìn)作用(p＜0.05)，但卻沒(méi)有階段效應(yīng);丁酸鈉對(duì)心肌分化的影響與

13、4-PBA的效應(yīng)是相似的。
　　(2)在誘導(dǎo)分化的早期轉(zhuǎn)染內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因pRK-ATF4，發(fā)現(xiàn)在早期對(duì)心肌特異性的轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5與Gata4的表達(dá)有提升作用，但是Gata4的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異，可能跟轉(zhuǎn)染效率有關(guān)。推測(cè)4-PBA對(duì)心肌分化的影響可能不是通過(guò)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了心肌的分化。
　　結(jié)論:
　　4-苯基丁酸(4-PBA)對(duì)胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞的影響是一個(gè)三階段的過(guò)程，