過氧化氫誘導(dǎo)的瑞氏木霉細胞凋亡研究及原生質(zhì)體細胞活力流式細胞術(shù)檢測.pdf

1、瑞氏木霉(TrichDderma reesei，anamorph：Hypocrea jecorina)是一種重要的工業(yè)絲狀真菌，是纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶以及蛋白酶的主要來源?？勺鳛樗拗鬏d體表達多種外源蛋白質(zhì)，具有重要的經(jīng)濟價值。此外瑞氏木霉作為低等多細胞真核生物，具有結(jié)構(gòu)簡單、生長迅速、操作簡便的特點，是真菌遺傳學(xué)與細胞生物學(xué)研究的理想生物材料。 細胞凋亡(apoptosis)屬于程序性細胞死亡(PCD)，是受到精密調(diào)控的

2、細胞自殺過程。在高等動物中，細胞凋亡紊亂可導(dǎo)致多種疾病，如癌癥、艾滋病等。因此細胞凋亡一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿與熱點，并于2002年獲得諾貝爾獎醫(yī)學(xué)獎。目前關(guān)于酵母和絲狀真菌的細胞凋亡研究正在成為生命科學(xué)新的方向。工業(yè)發(fā)酵過程中，好氧真菌瑞氏木霉時刻暴露于氧化壓力(oxidativestress)下，常導(dǎo)致菌絲死亡，這一過程可能由細胞凋亡引起。 為研究氧化壓力致死機理，本文選擇活性氧物質(zhì)H2O2模擬氧化壓力。研究表明，低濃度的H

3、2O2可導(dǎo)致瑞氏木霉QM9414原生質(zhì)體細胞活力發(fā)生可逆性的下降；而較高濃度的H2O2可導(dǎo)致原生質(zhì)體活力發(fā)生不可逆的下降，直至全部死亡.顯微鏡觀察結(jié)果顯示，2.4 mmol/L H2O2處理后的瑞氏木霉菌絲出現(xiàn)細胞質(zhì)“起泡”及原生質(zhì)體凝縮等絲狀真菌細胞凋亡的表型特征。Annexin V染色證明PS外翻這一凋亡生化表型。此外，PI染色排除了細胞壞死的可能性。對于動物細胞凋亡中常見的DNA ladder現(xiàn)象，瑞氏木霉與其他大多數(shù)真菌中的情況

4、類似，未發(fā)現(xiàn)DNAladder。本文證明細胞凋亡機制在瑞氏木霉細胞中具有保守性。為解釋發(fā)酵過程中的菌體死亡提供了新的思路。 流式細胞術(shù)(F1ow cytometry，F(xiàn)CM)是一種基于熒光的細胞生物學(xué)分析手段，能快速檢測細胞群體中單個細胞的性質(zhì)。在動物、植物乃至酵母細胞凋亡研究中有廣泛應(yīng)用。但由于菌絲形態(tài)的限制，流式細胞術(shù)在絲狀真菌中應(yīng)用有限。對于原生質(zhì)體的檢測目前尚未見報道。 本文以瑞氏木霉作為研究對象，成功建立了應(yīng)用

5、流式細胞術(shù)檢測絲狀真菌原生質(zhì)體細胞活力的方法。采用綠色熒光蛋白GFP結(jié)合PI的策略檢測了不同濃度H2O2作用后的原生質(zhì)體活力。其結(jié)果與熒光顯微鏡觀察和平板計數(shù)結(jié)果完全一致。證明流式細胞術(shù)是一種有效而準確的原生質(zhì)體活力鑒定方法。該研究將為絲狀真菌原生質(zhì)體細胞凋亡檢測提供重要參考。本文證明細胞凋亡機制在瑞氏木霉中具有保守性。2.4mmol/LH2O2可導(dǎo)致瑞氏木霉原生質(zhì)體細胞凋亡。目前正在嘗試通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除的方法阻斷細胞凋亡信號通路，