灰色鏈霉菌RX-17產(chǎn)β-1，4-N，6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)和耐酸性分子改造.pdf

1、在添加了變形鏈球菌的雙層平板上，篩選到一株高產(chǎn)溶菌酶的灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)RX-17，經(jīng)過CM Sepharose Fast Flow離子交換層析以后得到兩個(gè)β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶組分，通過GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的由球孢鏈霉菌所產(chǎn)生的β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶M1序列進(jìn)行比對，找出同該酶同源性最高的50個(gè)序列，而后對這50個(gè)序列進(jìn)行比對，找出β-1，4-N,6-O-二乙酰

2、胞壁質(zhì)酶最保守的兩個(gè)短氨基酸序列，同時(shí)根據(jù)鏈霉菌基因組堿基構(gòu)成的特點(diǎn)使用互聯(lián)網(wǎng)引物設(shè)計(jì)程序設(shè)計(jì)了CODEHOP(Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide Primers)引物，并成功克隆出了β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2保守區(qū)基因序列，進(jìn)而通過TAIL PCR擴(kuò)增出了全長基因序列。對β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，分別使用了pET-28a(+)、

3、pBV220、pGEX-4T-1、pMAL-c2E以及pET-26b(+)等表達(dá)質(zhì)粒，以及BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3)、Rosetta-gamiTM(DE3)等宿主菌，結(jié)果表明，在pET-28a(+)、pBV220中進(jìn)行表達(dá)，無論使用哪種宿主菌，通過任何方法都無法檢測到生物活性亦無法通過SDS-PAGE檢測到明顯的蛋白條帶，這說明目的蛋白沒有表達(dá)，可能是由于β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶本身對于大腸桿菌

4、是一種毒性蛋白，因此抑制了酶的表達(dá)。使用pGEX-4T-1進(jìn)行融合表達(dá)，通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)能夠得到大量的表達(dá)，然而表達(dá)產(chǎn)物以錯(cuò)誤折疊無生物活性的包涵體形式存在于細(xì)胞內(nèi)，僅有少量可溶性表達(dá)，將可溶性部分通過GST Bind Resin進(jìn)行分離純化，并經(jīng)過凝血酶切割，仍然無法得到具有生物活性的表達(dá)產(chǎn)物，這可能是因?yàn)榭扇苄员磉_(dá)的蛋白量過少或者蛋白是錯(cuò)誤折疊的無活性分子。使用pMAL-c2E融合表達(dá)載體成功表達(dá)出可溶性的β-1，4-N,6

5、-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶，經(jīng)過.Amylose Resin純化并用腸激酶切除融合標(biāo)簽以后能夠得到具有生物活性的酶蛋白。通過測定發(fā)現(xiàn)重組酶R2最適作用pH同由灰色鏈霉菌所產(chǎn)的野生型β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2相同，均為7.0左右，最適作用溫度約為50℃，較野生型β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R2低，然而在37℃的酶活卻比野生型酶有明顯提高。使用pET-26b(+)質(zhì)粒在BL21(DE3)pLysS能得到少量在周質(zhì)空間表達(dá)

6、的有生物活性的酶蛋白，但是通過SDS-PAGE和比濁法都無法檢測到酶活，僅能通過誘導(dǎo)表達(dá)后大腸桿菌宿主菌發(fā)生自身降解以及瓊脂平板擴(kuò)散法檢測到活性，這可以作為后續(xù)突變中的篩選方法。由于β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶具有水解變形鏈球菌的能力，同時(shí)對于齲齒的防治具有較好的效果，因此具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。然而口腔中的微酸性環(huán)境卻不利于酶作用的充分發(fā)揮，為了能夠提高酶分子在微酸性條件下的活性，需要對酶進(jìn)行耐酸性的改造。根據(jù)已知的天藍(lán)色鏈霉菌

7、所產(chǎn)的Cellosyl的晶體結(jié)構(gòu)，確定了酶的活性中心位于9-Asp、98-Asp和100-Glu，因此選取了在空間結(jié)構(gòu)中靠近活性中心氨基酸同時(shí)又不參與任何底物結(jié)合于催化反應(yīng)的183-Gln作為定點(diǎn)突變的對象，突變的結(jié)果表明將其突變?yōu)镚lu，最適作用pH發(fā)生了酸移，而將其突變?yōu)锳la，最適作用pH未發(fā)生改變，將其突變?yōu)長ys以后，酶活完全喪失。另外由于62-Tyr和138-Tyr同樣位于活性中心區(qū)域附近，同時(shí)保守性較高，因此又對酶的138

8、-Tyr和62-Tyr再加上183-Gln進(jìn)行了三點(diǎn)飽和突變，結(jié)果表明在選取的200個(gè)飽和突變體中大多數(shù)酶活喪失，在酶活仍存留的突變體中僅有5個(gè)發(fā)生了最適作用pH酸移，大部分最適pH沒有發(fā)生改變。經(jīng)過測序表明，62位Tyr和138位Tyr的突變對于改變酶的最適作用pH方面沒有太大影響，Tyr突變?yōu)槎喾N氨基酸僅對酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了影響，而183位Gln的突變則影響了酶的最適作用pH，在獲得的5個(gè)最適作用pH酸移的突變體中有4個(gè)Gln均突變

9、為酸性氨基酸，還有一個(gè)突變?yōu)镾er，同定點(diǎn)突變的結(jié)果是一致的。這說明突變后的酸性氨基酸能夠提供質(zhì)子，從而影響活性中心區(qū)域氨基酸的解離，使得酶的活性中心氨基酸pKa值發(fā)生改變，最終導(dǎo)致最適作用pH發(fā)生變化。 對灰色鏈霉菌RX-17基因組中另一個(gè)β-1，4-N，6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶組分R5也進(jìn)行了克隆。在已經(jīng)得到的CODEHOP引物5’末端添加抑制序列的方法設(shè)計(jì)出同源抑制PCR的引物HRPP(Homologous restrain

10、t PCR primer)，并進(jìn)行了同源抑制PCR擴(kuò)增出了其保守區(qū)域，進(jìn)而通過TAIL PCR得到其基因全長。R5基因全長825bp，經(jīng)過比對，R2基因同R5基因同源性為79％， R5基因翻譯成的蛋白序列經(jīng)過SignalP服務(wù)器分析為典型分泌型蛋白。通過構(gòu)建的進(jìn)化樹分析表明，R2和R5兩種酶蛋白的親緣性較遠(yuǎn)，同一個(gè)菌株所產(chǎn)的同一種類型的酶卻有著較大的差距。按照信號肽預(yù)測軟件的結(jié)果，對β-1，4-N,6-O-二乙酰胞壁質(zhì)酶R5的成熟肽基因