基因組改組技術(shù)選育耐酸性琥珀酸放線桿菌.pdf

1、琥珀酸是工業(yè)上一種重要的C4平臺(tái)化合物，它作為有機(jī)合成原材料、中間產(chǎn)物或化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于制藥、食品添加劑、綠色溶劑及可降解塑料等多種領(lǐng)域。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸因具有對(duì)環(huán)境友好和擺脫對(duì)石化原料依賴的特性，已成為國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。本文采用基因組改組技術(shù)選育耐酸性琥珀酸產(chǎn)生菌株。以琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes CGMCC1593為出發(fā)菌株，分別經(jīng)過紫外線-甲基磺酸乙酯(UV-EMS)和紫外線-硫酸二

2、乙酯(UV-DES)誘變處理，得到7株耐酸性有所提高的突變株，以此為基因組改組的出發(fā)菌庫(kù)，經(jīng)三輪原生質(zhì)體遞進(jìn)融合，篩選獲得4株能夠在pH5.6條件下生長(zhǎng)良好且產(chǎn)酸提高的改組菌株，并對(duì)其中一株F3-21的發(fā)酵性能進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 ⑴通過菌種生長(zhǎng)特性的試驗(yàn)，確定篩選平板和液體篩選培養(yǎng)基的臨界pH為5.6；確定采用菌齡12 h的菌體進(jìn)行誘變處理和原生質(zhì)體的制備。通過致死曲線的測(cè)定，確定UV-EMS誘變的條件為UV照

3、射20 s，2.0% EMS處理30 min； UV-DES誘變的條件為UV照射20 s，0.8% DES處理20 min。A.succinogenes CGMCC1593分別經(jīng)上述兩種方法誘變，經(jīng)低pH篩選平板和液體篩選培養(yǎng)基初篩，厭氧瓶發(fā)酵復(fù)篩后，獲得7株耐酸性較好的高產(chǎn)突變株UE-7、UE-10、UE-12、UE-16、UD-6、UD-11、UD-15。
　　 ⑵通過對(duì)菌體原生質(zhì)體制備、再生及融合的影響因素試驗(yàn)，確定:細(xì)胞

4、壁酶解前添加0.4%的甘氨酸促進(jìn)酶解，原生質(zhì)體制備條件為溶菌酶濃度0.1 mg/mL，37℃酶解30min；緩沖液為PB磷酸高滲液；原生質(zhì)體再生培養(yǎng)方式采用雙層平板再生；原生質(zhì)體經(jīng)37℃融合5 nun時(shí)的融合率達(dá)2.78×10-5。
　　 ⑶通過三輪多母本原生質(zhì)體遞進(jìn)式融合，篩選得到4株耐酸性較好的高產(chǎn)改組菌F3-5、F3-9、F3-14和F3-21，其中F3-21搖瓶發(fā)酵48 h琥珀酸產(chǎn)量為34 g/L，較原始親株提高48%。

5、并且，F(xiàn)3-21的耐酸性相對(duì)原始親株有明顯提高。在pH5.8的完全液體培養(yǎng)基中，F(xiàn)3-21的菌體濃度為原始親株的2.5倍；pH5.6時(shí)為原始親株的7倍，且在pH5.2時(shí)F3-21仍能生長(zhǎng)。
　　 ⑷在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵，用MgCO3控制低pH(pH5.6-6.0)厭氧發(fā)酵48 h，F(xiàn)3-21積累琥珀酸38.1 g/L，較原始親株(26.2 g/L)提高45%，MgCO3總的用量比原始菌減少了22.5%?？刂普H( pH

6、6.5-7.0)厭氧發(fā)酵32 h，F(xiàn)3-21產(chǎn)琥珀酸40.7 g/L，糖利用率81.4%。采用補(bǔ)料分批發(fā)酵策略時(shí)，F(xiàn)3-21發(fā)酵72 h琥珀酸最高產(chǎn)量達(dá)67.4 g/L。當(dāng)用相對(duì)廉價(jià)的Na2CO3控制發(fā)酵pH6.5分批發(fā)酵時(shí)，F(xiàn)3-21厭氧發(fā)酵32 h琥珀酸積累41.5 g/L，最終糖利用率達(dá)83%，略優(yōu)于MgCO3控制pH6.5-7.0策略的發(fā)酵水平(琥珀酸40.7 g/L，糖利用率81.4%)。表明Na2CO3可以代替MgCO3調(diào)節(jié)