人類RBBP10和bimα3的克隆和功能研究.pdf

1、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物控制組織細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制.細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡異常是多種人類疾病的根本原因.RB及bcl-2家族蛋白為細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的核心控制成分,它們各有其功能特點(diǎn)又彼此協(xié)調(diào).用RB口袋區(qū)結(jié)合蛋白保守功能域LxCxE和bcl-2凋亡關(guān)鍵功能域BH3 domain作為線索掃描新基因文庫(kù),我們分離到了一個(gè)新的RB結(jié)合基因-RBBP10和2個(gè)新的bim異構(gòu)體—bimα及bim β5.RBBP10編碼182個(gè)氨基酸,廣泛低表

2、達(dá)于多種人類組織,在腫瘤組織中表達(dá)水平較高.酵母雜交分析提示其具有和RB結(jié)合的能力,同時(shí)也可能與腫瘤標(biāo)志蛋白Prx1及人類新基因yrdC產(chǎn)物相互結(jié)合.在HEK293細(xì)胞作正/反義過(guò)表達(dá)發(fā)現(xiàn),RBBP10和yrdC可能有正性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期作用(反義過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖下降,對(duì)照:38.25±1.98﹪;RBBP10-:30.67±1.42﹪;yrdC-:33.53±1.00﹪),而Prx 1可能有負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期作用(正義過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖下

3、降,Prx 1+:30.95±1.63﹪).免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)RBBP10特異性表達(dá)于乳腺癌的癌巢腫瘤細(xì)胞而不表達(dá)于癌旁細(xì)胞,提示其可能是一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志基因.bimα3編碼79個(gè)氨基酸,在HEK293細(xì)胞其與bim L/S/α2有相似的亞細(xì)胞定位特性,過(guò)表達(dá)引起的細(xì)胞凋亡水平與bimα2相似(bimα2:30.14±2.66﹪;bim α3:32.05±6.42).提示BH3 domain為bim獲得線粒體定位及導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的充要條

4、件.Bim β5 cDNA長(zhǎng)349bp,用人工導(dǎo)入kozak序列的對(duì)比分析,鑒定了一個(gè)新的翻譯起始點(diǎn),確定bim β5編碼36氨基酸且含BH3 domian.同時(shí)人工構(gòu)建編碼28氨基酸且含BH3 domian的bim β6.轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,強(qiáng)度比bim α3弱(bim β5:28.17﹪;bim β6 28.13﹪).研究首次在細(xì)胞水平證明BH3核心序列可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,并提示bim蛋白BH3 domain N側(cè)序列可

5、能有一個(gè)加強(qiáng)bim導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的多肽片段.bim的表達(dá)譜分析提示bim的異構(gòu)體表達(dá)譜可能作為組織細(xì)胞分化和組織特性的標(biāo)志.bim L的酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)bim主要與MIF等抗凋亡蛋白結(jié)合,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其與其他bcl 2蛋白結(jié)合的證據(jù).AD293與HEK293對(duì)bim具有完全不同的反應(yīng)特性.差減分析發(fā)現(xiàn)AD293高表達(dá)parvin、actin等黏附蛋白及PMSA3等抗凋亡蛋白,提示改變細(xì)胞黏附特性可以改變細(xì)胞對(duì)bim介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的反應(yīng)特性.