人類心臟發(fā)育候選基因hole和DAND5的克隆與功能研究.pdf

1、 心臟是脊椎動(dòng)物器官發(fā)生過(guò)程中最早形成的結(jié)構(gòu)之一。心臟發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受一系列基因的精確調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，某些基因在時(shí)空上的表達(dá)紊亂可導(dǎo)致先天性心臟病。目前心血管系統(tǒng)疾病已經(jīng)成為威脅人類健康最大的兩個(gè)敵人之一。鑒定在心臟發(fā)育過(guò)程中起調(diào)控作用的基因和分子途徑，將促進(jìn)人們從分子水平認(rèn)識(shí)心臟發(fā)育和先天性心臟病發(fā)生的機(jī)制。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑是廣泛存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞調(diào)控的一種機(jī)制，許多轉(zhuǎn)錄因子是重要的MAPK靶分子。為了鑒定控制心臟發(fā)

2、育和疾病發(fā)生的新基因，本研究從心臟cDNA文庫(kù)中克隆了兩個(gè)人類新基因Hole和DAND5。Hole基因位于14號(hào)染色體，Northern雜交結(jié)果表明其僅在心臟、骨骼肌、肝臟、胰腺中有表達(dá)，而在心臟的表達(dá)最強(qiáng)烈。通過(guò)構(gòu)建增強(qiáng)型綠色熒光蛋白與hole融合基因的真核表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞系，瞬時(shí)表達(dá)后熒光顯微鏡觀察了它編碼蛋白的活細(xì)胞定位及表達(dá)，表明hole蛋白主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而且在細(xì)胞質(zhì)中點(diǎn)綴著大小不一的點(diǎn)狀熒光。DAND

3、5基因位于19號(hào)染色體，屬于DAN家族成員，已發(fā)現(xiàn)該家族成員能通過(guò)與骨形成蛋白(BMP)結(jié)合從而抑制其信號(hào)的傳導(dǎo)。人類胚胎時(shí)期RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明它在胚胎的各種組織中均有表達(dá).利用GST表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建pGEX-4T-2-DAND5融合蛋白，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)得到約48kDa的融合蛋白。構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-tag2C與DAND5的融合蛋白，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞系，建立轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，通過(guò)免疫組化染色證明DAND5蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)