厄貝沙坦對胞內(nèi)胞外氧化應激引起胰島NIT-1細胞損傷的研究.pdf

1、目的:胰島β細胞的損傷和凋亡是糖尿病發(fā)病的機理之一，引起機體胰島素分泌相對或絕對不足從而出現(xiàn)高血糖狀態(tài)。與其他組織細胞相比，胰島β細胞的抗氧化能力水平低。有研究報道高糖、高脂、炎性因子、鏈脲佐菌素、過氧化氫等均可引起胰島β細胞發(fā)生凋亡或壞死。隨著對糖尿病發(fā)病機制的不斷研究，有研究發(fā)現(xiàn)，在胰島β細胞的微生存環(huán)境中，高糖、高脂、炎性因子等在引起胰島β細胞凋亡或壞死的同時伴有腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin Angiotensin Syste

2、m，RAS)的激活。而目前已有大量的基礎研究證實在人、大鼠、小鼠、犬類等多種動物的胰腺上均存在合成血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)的獨立體系，并在胰腺局部發(fā)揮重要的調(diào)控作用。胰腺局部的RAS具有自身的特點，不依賴于腎臟，可以自身合成、釋放，并通過胞內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的方式來發(fā)揮對細胞的生長、分化、增殖、凋亡，組織炎癥及纖維化等的生理及病理生理作用。近年有循證醫(yī)學研究證實，使用血管緊張素受體拮抗劑(Angiotens

3、inreceptor blocker, ARB)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(Angiotensin-convertingenzyme inhibitor, ACEI)，可以有效降低具有高危因素（肥胖、心血管疾病、吸煙等）患者新發(fā)2型糖尿病的風險，其具體機制目前尚不清楚。本課題組的前期研究也證實血管緊張素受體1（AT1受體）拮抗劑厄貝沙坦可以拮抗高糖環(huán)境中胰島β細胞凋亡，其可能機制與抑制AT1R、AngⅡ mRNA表達，阻斷RAS通路，以及

4、抗氧化和下調(diào)凋亡相關基因Bax、Caspase-3mRNA的表達有關。本實驗選擇NOD小鼠胰島細胞瘤NIT-1胰島細胞，它具有胰島β細胞的功能，體外培養(yǎng)以存活，并通過不同途徑來源的氧化應激因素鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)及過氧化氫(H2O2)誘導胰島NIT-1細胞損傷，建立胰島細胞內(nèi)和細胞外氧化損傷模型，進一步進行厄貝沙坦對凋亡胰島NIT-1細胞觀察研究。本研究內(nèi)容分為兩部分:第一部分是建立胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細

5、胞損傷模型，第二部分是厄貝沙坦對鏈脲佐菌素及過氧化氫誘導胰島NIT-1細胞凋亡的影響，為臨床開展糖尿病的病因治療、指導糖尿病的防治提供實驗及理論依據(jù)。
　　材料和方法:本實驗設計分為兩部分，第一部分是建立胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細胞損傷模型:選取對數(shù)生長期的NOD小鼠胰島β細胞株NIT-1細胞，分別加入STZ和H2O2干預。第二部分是根據(jù)第一部分建立所得的NIT-1胰島β細胞凋亡模型基礎上，在上部分內(nèi)容的基礎上分別選取終濃度為2mm

6、ol/LSTZ、300μmol/L的H2O2干預細胞30min，棄干預液，分別加入不同濃度(0.1、0.01、0.001mmol/L及0mmo/L即無厄貝沙坦的陽性組)的厄貝沙坦培養(yǎng)液，按厄貝沙坦?jié)舛确纸M。根據(jù)不同實驗要求，第一部分實驗內(nèi)容:收集各組細胞，采用Hochest33342熒光染色法觀察各組細胞的凋亡形態(tài)，流式凋亡檢測技術檢測各組細胞的凋亡率，在所測得流式細胞凋亡率的基礎上，選擇誘導胰島NIT-1細胞凋亡率適中的STZ及H2O

7、2濃度組即（B組和D組）繼續(xù)進行RT-PCR技術檢測各組細胞凋亡因子Caspase-3 mRNA的表達。第二部分，以2mmol/LSTZ及300μmol/LH2O2誘導胰島NIT-1細胞凋亡，Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細胞儀技術凋亡各組細胞的凋亡率，CellROX流式細胞儀技術檢測各組細胞活性氧族（Reactive Oxygen Species，ROS）的含量，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應技術(RT-PCR)檢測各組細胞AT1、Caspa

8、se-3、NADPH mRNA的表達。
　　結果:第一部分胞內(nèi)胞外胰島NIT-1細胞氧化應激損傷模型各組細胞實驗結果:①Hochest33342熒光染色下各組細胞在熒光顯微鏡下細胞形態(tài)的描述:F組細胞的彌漫均勻淡藍色熒光，細胞形態(tài)較規(guī)則，多數(shù)細胞胞膜完整，A組細胞著色與細胞形態(tài)大致與F組相近，B組可見部分細胞細胞核成亮藍色熒光，胞核濃縮，細胞形態(tài)大小不一，C組和E組細胞熒光亮度不均一、細胞形態(tài)不規(guī)則、胞膜不完整，細胞碎片較多。D組

9、細胞部分細胞成強藍色熒光，并見細胞形態(tài)大小不一，有細胞碎片。②Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細胞儀技術檢測各組細胞凋亡率結果:A、B、C、D、E5組細胞凋亡率與F組比較，A、B、C、D、E5組細胞凋亡率顯著升高P＜0.05。③RT-PCR技術檢測B組D組及F組細胞Caspase-3的相對表達量結果:與F組比較，B組和D組的胰島NIT-1細胞Caspase-3增高(P＜0.05)。第二部分厄貝沙坦對STZ及H2O2誘導胰島NIT-1細胞

10、凋亡的影響實驗結果:①Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細胞儀技術檢測各組細胞凋亡率:G1、G2、G3組的細胞凋亡率均少于G4組(P＜0.05)，H1、H2、H3組的細胞凋亡率少于H4組，且細胞凋亡率隨著厄貝沙坦?jié)舛鹊脑黾蛹芭囵B(yǎng)時間的延長而逐漸減少。②CellROX流式細胞儀技術檢測各組細胞ROS相對含量的表達:G1、G2、G3組的細胞ROS相對含量均低于G4組(P＜0.05)，H1、H2、H3組的ROS相對含量低于H4組(P＜0.05)

11、，且細胞ROS的相對含量也隨著厄貝沙坦?jié)舛鹊脑黾蛹芭囵B(yǎng)時間的延長而逐漸減少。③RT-PCR技術檢測各組細胞基因的相對表達量結果:G1、G2、G3組的細胞ROS相對含量均少于G4組(P＜0.05)，H1、H2、H3組的ROS相對含量低于H4組(P＜0.05)，厄貝沙坦組的Caspase-3、NADPH mRNA的表達量下降(P＜0.05)，AT1 mRNA的表達量也呈下降趨勢(P＜0.05)。
　　結論:1、一定濃度的STZ及H2O