基于P38MAPK信號(hào)通路途徑的京尼平苷抗兔膝骨關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：驗(yàn)證京尼平苷是否通過作用P38MAPK通路，尋找京尼平苷抗兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的相關(guān)機(jī)制，從而為臨床應(yīng)用京尼平苷防治軟骨細(xì)胞類疾病提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。
　　方法：(1)24只新西蘭大白兔隨機(jī)分為：A正常組6只；B4周模型組6只；C8周模型組12只。對(duì)B、C組新西蘭大白兔采取改良Hulth法（既去除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶）制造兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，于飼養(yǎng)8周后將A、B、C組動(dòng)物統(tǒng)一處死，取關(guān)節(jié)軟骨組織 HE染色及

2、檢測(cè)關(guān)節(jié)液 IL-1、TNF-α對(duì)模型鑒定。(2)無菌提取A、C組軟骨組織，消化軟骨間質(zhì)，分離軟骨細(xì)胞，無菌培養(yǎng)。甲苯胺藍(lán)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫熒光鑒定軟骨細(xì)胞。檢測(cè) A、C組細(xì)胞培養(yǎng)液 IL-1、TNF-α的濃度用于鑒定骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞。(3)用MTT檢測(cè)京尼平苷對(duì)骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作用的最適時(shí)間及濃度。(4)將軟骨細(xì)胞分成 D:生理鹽水組、E:京尼平苷組、F:京尼平苷+P38抑制劑組、G:P38抑制劑組，分別培養(yǎng)并分別檢測(cè)檢測(cè)各

3、組P38MAPK通路上游介質(zhì)NO含量；(5)ELISA測(cè)定各組P38MAPK通路下游介質(zhì)MMP-13含量；(6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)P38mRNA；(7) Western-Blot測(cè)定各組P38MAPK通路蛋白的表達(dá)。各項(xiàng)數(shù)據(jù)釆用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：(1)通過形態(tài)學(xué)及各項(xiàng)生化指標(biāo)表明兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建成功。8周后ELISA檢測(cè)IL-1、TNF-α結(jié)果發(fā)

4、現(xiàn)，與A組相比，B、C組IL-1、TNF-α顯著升高(P<0.05)。(2)原代兔膝OA軟骨細(xì)胞呈多角形，培養(yǎng)72h后基本貼壁，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)加快，隨著傳代次數(shù)的增加細(xì)胞逐漸出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，呈圓形，多短觸角；II型膠原免疫組織細(xì)胞技術(shù)、II型膠原免疫熒光法、甲苯胺藍(lán)染色法測(cè)得細(xì)胞為軟骨細(xì)胞來源，(3)隨著給藥濃度的不同（0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml）對(duì)兔膝OA軟骨細(xì)胞增殖

5、有明顯的促進(jìn)作用，京尼平苷于濃度為10μg/ml培養(yǎng)72h對(duì)軟骨細(xì)胞增殖作用最佳（P<0.05）；(4)生化檢測(cè)NO結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，京尼平苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組NO表達(dá)量顯著下降（P<0.05）；(5)ELISA檢測(cè)MMP-13結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，京尼平苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組MMP-13表達(dá)量顯著下降（P<0.05）；(6) PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，京尼平

6、苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組P38mRNA表達(dá)量顯著下降（P<0.05）；(7) Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水組相比，京尼平苷組、京尼平苷+P38抑制劑組、P38抑制劑組P38/GAPDH表達(dá)量無差異（P＞0.05）；京尼平苷組、京尼平苷+ P38抑制劑組、P38抑制劑組P-p38/GAPDH表達(dá)量顯著下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：京尼平苷對(duì)體外培養(yǎng)的兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞有一定的增殖作用，并