Cyclin D3相關(guān)蛋白的篩選及其與ERK3或nm23-H2相互作用的研究.pdf

1、細胞周期是推動細胞分裂，進而使器官組織增殖、發(fā)育的重要機制。細胞周期分為四個不同的時相：G1期，S期，G2期和M期。細胞周期的正常推進是由細胞周期蛋白(cyclins)，細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinases，CDKs)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin—dependent虹naseinhibitor，CKIs)等多種蛋白構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)的。哺乳動物D類細胞周期蛋白，即cyclinD1，D

2、2，D3，能夠結(jié)合并激活相應的激酶CDK4或CDK6，因此是細胞Gl／S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)。這三種D型cyc¨ns在結(jié)構(gòu)上具有很高的同源性，而且都能促進細胞G1期推進，也具有相似的細胞周期調(diào)控功能。但是，各型cyclinD在組織細胞中的表達以及除細胞周期調(diào)節(jié)外的其它方面功能又具有各自的特征。與cyclinD1和D2相比，cyclinD3組織表達最為廣泛；而且在一些特定類型的組織或細胞中，在發(fā)育、增殖、分化及腫瘤發(fā)生等多種生理或病理過程

3、中發(fā)揮著獨特的作用。為了闡明cyclinD3不同于D1和D2的功能或特征，我們利用酵母雙雜交技術(shù)，以人cyc¨nD3為誘餌，篩選人胎肝cDNA文庫。我們獲得了包括ERK3，nm23一H2在內(nèi)的一些能與cyc¨nD3相互作用的蛋白。本研究中，我們證實了cyc¨nD3與ERK3或nm23一H2之間的相互作用，并對它們相互作用的生物學意義做了進一步的研究。 ERK3(Extracellularsignal-regulatedkinas

4、e3)最初是通過與ERKl的高度同源性而被分離獲得的，被認為是一種非典型的MAP激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)。迄今為止，關(guān)于ERK3的功能和調(diào)控還知之甚少。與以前報道相一致，我們的實驗也表明，在ERK3蛋白的氨基端而非羧基端偶聯(lián)大的標記分子如GFP，能穩(wěn)定ERK3蛋白，提高它在細胞內(nèi)的表達水平。CyclinD3和ERK3之間的相互作用在體外和體內(nèi)都得到了證實。GST融合蛋白沉降實驗分析表

5、明cyclinD3可直接，特異地與ERK3在體外相結(jié)合；而cyclinD1或D2與ERK3之間并沒有明顯的結(jié)合。CyclinD3和ERK3的體內(nèi)結(jié)合通過免疫共沉淀實驗和激光共聚焦分析得到進一步確證。而且，我們也闡明ERK3的羧基端對于它與cyclinD3的結(jié)合是必須的。對于cyclinD3而言，則只有全長的cyclinD3才能結(jié)合ERK3，這提示cyclinD3的整體構(gòu)象對于相互作用的重要性。這些結(jié)果提示cyclinD3具有不同于D1或

6、D2的獨特作用，同時我們推測ERK3在細胞增殖中可能有著潛在的重要作用。 Nm23家族蛋白起初被證實是一類重要的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白，也被稱為核菅二磷酸激酶(nucleosidedi曲osphatekinase，NDPK)。后續(xù)研究表明，nm23家族蛋白廣泛參與了增殖、發(fā)育、分化、腫瘤遷移以及信號轉(zhuǎn)導等多種生理和病理活動。Nm23-H2(NDPKB)屬于人類nm23蛋白激酶家族成員之一。Nm23-H2通過結(jié)合c-myc基因啟動子區(qū)

7、的NHE(nuclease-hypersensitiveelement)元件，促進c-myc基因的轉(zhuǎn)錄，因而也被稱為PuF因子。目前研究中，我們通過雙雜交，篩選并證實了nm23-H2為cyclinD3一個新的相互作用蛋白。與ERK3相類似，nm23-H2也能特異地與cyclinD3相結(jié)合。體外結(jié)合實驗表明cyclinD3可與nm23-H2直接相互作用。同樣，免疫共沉淀和激光共聚焦分析顯示了二者在體內(nèi)的結(jié)合。此外，cyclinD3能在一定