Cyclin D3與elF3k的相互作用及TH1與A-Raf相互作用的研究.pdf

1、在細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程中,有兩大家族的蛋白發(fā)揮著重要的作用.一個(gè)家族是CDK,它們磷酸化特異的蛋白來(lái)調(diào)節(jié)下游通路.另一個(gè)家族是專門的調(diào)節(jié)蛋白cyclins,它們與CDK分子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)CDK的激酶活性.當(dāng)細(xì)胞從靜止期進(jìn)入細(xì)胞分裂時(shí),編碼D型cyclin的基因在G1期被激活,cyclin D隨之與CDK4或CDK6形成一個(gè)復(fù)合物,活化后的激酶復(fù)合物磷酸化底物蛋白調(diào)控下游的通路.在cyclin D中,cyclin D3不僅作為一個(gè)CDK4和CD

2、K6的調(diào)節(jié)亞基在G1期調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程,還與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和凋亡有關(guān).我們實(shí)驗(yàn)室報(bào)導(dǎo)了一個(gè)G2/M期的CDK-CDK11<'P58>,也能特異地與cyclin D3在G2/M期相互作用.為了進(jìn)一步了解cyclin D3在細(xì)胞里的功能,我們以cyclin D3為誘餌蛋白,用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎肝cDNA文庫(kù),找到了與cyclin D3結(jié)合的蛋白eIF3k(真核翻譯起始因子3的p28亞基).cyclin D3與eIF3k的相

3、互作用是特異性的,因?yàn)槲覀儧](méi)有檢測(cè)到eIF3k與其它c(diǎn)yclin D的相互作用.我們構(gòu)建了cyclin D3的缺失突變體,用酵母雙雜交的方法明確了cyclin D3與eIF3k相互結(jié)合所需的區(qū)域位于cyclin D3的第154-292氨基酸之間,這一區(qū)域是cyclin D同源性最低的部位.我們進(jìn)一步用體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)的免疫共沉淀和激光共聚焦確定了cyclin D3和eIF3k的相互作用.激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)eIF3k分布于細(xì)胞質(zhì)和

4、細(xì)胞核中,cyclin D3與eIF3k在細(xì)胞內(nèi)不僅具有共定位,而且過(guò)表達(dá)cyclin D3會(huì)影響eIF3k在細(xì)胞中的分布,使更多的eIF3k蛋白集中在細(xì)胞核中.過(guò)表達(dá)eIF3k會(huì)抑制細(xì)胞的翻譯活性,而過(guò)表達(dá)cyclin D3則會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的翻譯活性,同時(shí)轉(zhuǎn)錄水平不受影響.這為我們進(jìn)一步理解cyclin D3和eIF3k在細(xì)胞中可能的的功能提供了有益的線索.細(xì)胞通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路將來(lái)自細(xì)胞外各種刺激傳導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi),調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而使細(xì)胞

5、產(chǎn)生增殖、分化、凋亡等生命活動(dòng).在我們實(shí)驗(yàn)室以前的的工作中,采用酵母雙雜交的方法,以A-Raf為誘餌蛋白篩選了人胎肝cDNA文庫(kù),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與A-Raf相互作用的蛋白trihydrophobin 1(TH1).TH1是2000年克隆的一個(gè)新基因,對(duì)于它的功能方面還沒(méi)有研究.該實(shí)驗(yàn)中對(duì)TH1與A-Faf的相互作用進(jìn)行了進(jìn)一步的研究.在GST pull-down實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了TH1與A-Raf的相互作用,并通過(guò)酵母共轉(zhuǎn)化和GST pull-d

6、own發(fā)現(xiàn)TH1蛋白N端1-392氨基酸的區(qū)域?qū)τ谶@種結(jié)合是至關(guān)重要的.激光共聚焦顯微鏡觀察也證實(shí)了TH1與A-Raf在細(xì)胞內(nèi)的共定位.我們的實(shí)驗(yàn)還表明TH1與A-Raf的相互作用是特異性的,因?yàn)門H1與Raf家族的另兩個(gè)成員B-Raf和c-Raf不能相互作用.另外,激光共聚焦結(jié)果顯示,TH1和A-Faf的相互作用并不僅僅局限于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上,而通過(guò)對(duì)TH1蛋白結(jié)構(gòu)域分析,我們發(fā)現(xiàn)其似乎不具有激酶結(jié)構(gòu)域,推測(cè)有可能是一種新的構(gòu)架蛋白.