膠原蛋白的提取工藝、質(zhì)量分析研究及其在生物膜材料中的應(yīng)用.pdf

1、目的：膠原蛋白作為天然動(dòng)物生物質(zhì)資源，在生物材料等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用深受?chē)?guó)內(nèi)外關(guān)注。膠原蛋白顯著的低免疫原性、生物相容性、可降解性，具有止血功能，并且在生物體內(nèi)容易被吸收，親水性強(qiáng)、無(wú)毒安全性好，是作為生物材料的優(yōu)勢(shì)，目前特別是在組織工程材料方面膠原蛋白得到了廣泛的應(yīng)用研究。本文在膠原蛋白的提取、質(zhì)量分析方面及其生物膜方面的應(yīng)用進(jìn)行了一些創(chuàng)新性研究。 方法： 1.膠原蛋白提取工藝的研究： 本研究以牛跟鍵為制備

2、原料，比較酸溶法、酶解法、中性鹽溶液法三種粗提方法，選擇得率和純度都較高的方法為最佳粗提法，結(jié)合高效液相色譜進(jìn)行膠原蛋白的分離純化。 2.膠原蛋白的質(zhì)量的研究通過(guò)膠原蛋白理化性質(zhì)研究：SDS-PAGE測(cè)定：紫外最大吸收測(cè)定；氨基酸測(cè)定；色譜分析純度，對(duì)膠原蛋白的質(zhì)量進(jìn)行控制。通過(guò)小鼠急性毒性試臉、豚鼠致敏試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)自制膠原蛋白進(jìn)行整體水平和細(xì)胞水平的生物安全性評(píng)價(jià)。 3.對(duì)膠原生物膜材料應(yīng)用的研究用提取的膠

3、原樣品冷凍干燥成膜，根據(jù)生物膜材料的特性要求，本文選用了具有獨(dú)特的生理、藥理活性的單寧酸為交聯(lián)劑。通過(guò)考察單寧吸收量和膠原膜穩(wěn)定性之間的關(guān)系、單寧酸交聯(lián)的膠原膜的熱穩(wěn)定性和抗酶解能力來(lái)評(píng)價(jià)單寧酸交聯(lián)膜。結(jié)果： 1.膠原蛋白提取工藝的研究： 在酸溶法、酶解法、中性鹽溶液法三種粗提方法中，選擇得率和純度都較高的方法酶解法；結(jié)合高效液相色譜進(jìn)行膠原蛋白的分離純化得到的I型膠原蛋白與I型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，樣品的保

4、留時(shí)間是14.348，標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間是14.251。 2.膠原蛋白的質(zhì)量分析的研究樣品在223 nm處有紫外最大吸收值：含有十八種氨基酸，氨基酸總量在90％以上；樣品的蛋白質(zhì)濃度為1.03mg/ml；SDS-PAGE測(cè)定Ⅰ型膠原蛋白由α、β、γ三條鏈組成；色譜分析純度約為100％。通過(guò)小鼠急性毒性試臉、豚鼠致敏試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)對(duì)自制膠原蛋白進(jìn)行整體水平和細(xì)胞水平的生物安全性評(píng)價(jià)，觀察期內(nèi)，小鼠未見(jiàn)異常毒性反應(yīng)：豚鼠注射點(diǎn)無(wú)

5、紅斑及水腫情況：細(xì)胞毒性小于1級(jí)，結(jié)果證明本方法制備的膠原蛋白無(wú)毒副作用。 3.膠原生物膜材料的研究3.1膠原經(jīng)交聯(lián)和干燥后，單寧酸的吸收量達(dá)到15～34％。 3.2，隨著單寧酸被膠原膜的吸收量增加，單寧酸在膠原膜內(nèi)被結(jié)合的量也有所增加，引起了Tm的提高。 3.3未交聯(lián)膠原膜、戊二醛交聯(lián)膠原膜、和單寧酸交聯(lián)膠原膜三種樣品，各切成均勻小樣4片。按10U/mg膠原計(jì)算酶的用量，將小樣置于該胰蛋白酶清液中處理消化

6、。消化時(shí)間為4h，期間注意變化，每個(gè)樣品共取樣四次，取樣后用大量蒸餾水仔細(xì)漂洗，停止酶降解反應(yīng)。酶降解后測(cè)定膠原膜機(jī)械性能變化。可以看出，未交聯(lián)膠原膜降解迅速，接近40min內(nèi)即喪失90％左右的抗張強(qiáng)度；戊二醛交聯(lián)膠原膜在40min左右還保留著50％的抗張強(qiáng)度，臨近4h酶解過(guò)程結(jié)束時(shí)，抗張強(qiáng)度明顯降低；而單寧酸交聯(lián)的膠原膜變化不大。 結(jié)論： 1.以牛跟鍵為材料，選擇得率和純度都較高的酶解法為最佳粗提法，結(jié)合高效液相色

7、譜制備Ⅰ型膠原蛋白。 2.通過(guò)紫外光譜掃描、氨基酸組成及含量測(cè)定、蛋白質(zhì)濃度、SDS-PAGE和RP-HPLC分析對(duì)所提取的I型膠原蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)鑒定，結(jié)果證明上述制備方法可得到純度較高的Ⅰ型膠原蛋白。體內(nèi)外安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法制備的Ⅰ型膠原蛋白無(wú)毒副作用。 3.膠原生物膜材料的研究3.1膠原膜對(duì)單寧酸的吸收量達(dá)到15-34％。單寧酸溶液濃度越高，膠原膜吸收的單寧酸就越多。 3.2在交聯(lián)過(guò)程中，吸收量