新生隱球菌生物膜外分泌蛋白初步分析的研究.pdf

1、生物膜是指由細(xì)胞外多聚基質(zhì)以及被粘結(jié)的菌團(tuán)組成。換言之，生物膜是一種附著于活組織或無(wú)活力組織的表面、由其自身產(chǎn)生的ECM包裹的由結(jié)構(gòu)的菌細(xì)胞群體，是一種獨(dú)特而復(fù)雜、相互依存的與表面有關(guān)的微生物群體，是細(xì)菌、真菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而形成的一種與懸浮細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的生存方式。生物膜的顯著特點(diǎn)是具有高度耐藥性。目前估計(jì)約65％的人類感染與生物膜有關(guān)[1]，而有學(xué)者認(rèn)為大于80％的人類感染中有生物膜的形成[1]。近30年來(lái)隨著廣譜抗生素和免

2、疫抑制劑的大量使用，加上癌癥及器官移植患者的增加，以及醫(yī)學(xué)材料使用的增多，新生隱球菌感染呈上升之勢(shì)。其中相當(dāng)一部分與新生隱球菌形成生物膜密切相關(guān)。感染部位一旦形成生物膜或植入人體內(nèi)的生物材料表面一旦形成了生物膜，由于其難以被大多數(shù)抗真菌藥物等徹底殺滅，新生隱球菌生物膜引起的感性性疾病因而大都是慢性和難治性的。近年來(lái)有關(guān)新生隱球菌生物膜的基礎(chǔ)研究和臨床研究已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視。
　　 為了深入了解新生隱球菌生物膜的相關(guān)特征，

3、首先應(yīng)該對(duì)其形成的生物膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。研究表明，生物膜的形成可以有幾個(gè)明顯的階段；MTT比色法是目前定量研究真菌生物膜最常用的方法，能夠間接反映生物膜中活細(xì)胞的數(shù)量，從而分析生物膜的形成過(guò)程。iTRAQ技術(shù)在分離蛋白質(zhì)混合樣品，比較差異方面有不可替代的作用，它是目前比較新的一種分離成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)組份的方法，與傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)相比，在差異蛋白鑒定種類、分子量、靈敏性等方面都有著不可比擬的優(yōu)勢(shì)。本研究利用倒置相差顯微鏡及MTT比色法分

4、析新生隱球菌生物膜形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程，為進(jìn)一步了解新生隱球菌生物膜特性及其耐藥機(jī)制提供理論依據(jù)；同時(shí)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基96孔板培養(yǎng)的方法構(gòu)建生物膜體外模型以及將菌懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于搖床上低速培養(yǎng)的方法構(gòu)建新生隱球菌懸浮態(tài)模型，提取上清液中的外分泌蛋白，對(duì)外分泌蛋白進(jìn)行初步純化處理后運(yùn)用iTRAQ技術(shù)對(duì)其進(jìn)行初步分析，尋找與生物膜形成有關(guān)的蛋白分子，為進(jìn)一步了解新生隱球菌群體效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，新生隱球菌可以在微孔板上