基于細菌群體感應的自殺基因回路的數(shù)學建模及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、細菌的自殺行為是自然界的一種常見現(xiàn)象，它是原核生物的一種程序性死亡機制。群體感應（quorum sensing,QS）是細菌細胞間的一種通訊形式。細胞合成并分泌信號分子，當環(huán)境中的信號分子濃度達到一定閾值時，一系列基因被激活，細菌種群會同步化地實現(xiàn)某些功能和行為上的改變?；谌后w感應的自殺基因回路已經(jīng)構建，對這一基因回路的系統(tǒng)研究和精確調(diào)控在理論和應用上都具有重要意義。
　　本論文以合成生物學的研究思路，以基于群體感應LuxR-L

2、uxI體系的自殺基因回路為研究對象，將數(shù)學建模和分子生物學實驗結合起來，模擬種群的生長和自殺行為，分析誘導劑IPTG濃度、pH值、溫度、營養(yǎng)條件等因素對系統(tǒng)行為的影響，目的是實現(xiàn)系統(tǒng)回路的長期、穩(wěn)定、可控的運行。本文還深入探討了營養(yǎng)條件對群體感應Plux啟動子的影響，發(fā)現(xiàn)了啟動子上游兩個調(diào)控序列對該啟動子復雜微妙的調(diào)控機制，從而深化了對細菌群體感應的認識。
　　本論文建立的基因回路安裝在pPopctrl質(zhì)粒上，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌

3、在有IPTG存在時會分泌一種信號分子（acyl-homoserine lactone,AHL），當AHL積累到一定閾值時會結合轉(zhuǎn)錄因子LuxR，并使之活化為LuxR*。后者啟動Plux啟動子的轉(zhuǎn)錄，CcdB毒蛋白表達并殺死細胞。本文通過常微分方程構建數(shù)學模型來研究菌群的生長和自殺行為。模型以 IPTG濃度、pH值、溫度以及營養(yǎng)條件為自變量，以不同時間點菌液的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）為因變量，模型與實

4、驗數(shù)據(jù)擬合良好。對各參數(shù)的獨立分析表明：IPTG濃度與LuxR蛋白生成量正相關，IPTG濃度越高，LuxR*越多，Plux啟動子啟動越頻繁，自殺越劇烈。pH值影響AHL分子的降解常數(shù)，pH值越大，AHL分子降解越快，信號分子濃度越低，自殺強度變小。溫度影響細菌的比生長速率以及LuxR*的解離常數(shù)，30℃時，比生長速率較慢，但LuxR*蛋白最穩(wěn)定，細菌的自殺行為顯著強于37℃。
　　營養(yǎng)條件對基因回路的運行和細菌種群的自殺行為有重要

5、影響。在貧營養(yǎng)的M9培養(yǎng)基中，幾乎觀察不到自殺現(xiàn)象，這暗示著群體感應潛在具有未知的、與營養(yǎng)水平相關的調(diào)控機制。為此，本文將Plux啟動子下游的ccdB基因替換為綠色熒光蛋白基因，觀察不同培養(yǎng)基、不同調(diào)控序列作用下的熒光表達情況。實驗結果表明：野生型啟動子Plux是弱的組成型啟動子，有本底水平表達的能力，但其表達量幾乎可以忽略，其主要依賴轉(zhuǎn)錄因子LuxR*的調(diào)控才能啟動 GFP的大量表達。在啟動子Plux上游存在luxbox序列和crp序

6、列兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。在一般情況下，Plux啟動子由與luxbox序列相關的luxR/I系統(tǒng)來調(diào)控，符合群體感應系統(tǒng)所介紹的調(diào)節(jié)規(guī)律。但當缺乏碳源或者營養(yǎng)匱乏時，cAMP升高，與cAMP結合蛋白結合生成cAMP-CRP蛋白復合物，此復合物能結合在crp序列上，在無AHL信號分子時，也能啟動Plux。在有AHL存在時，CRP復合物與crp序列的結合反而阻抑luxbox與啟動子Plux結合以及自身本底水平的表達。
　　本文建立的常微分方