游離DNA能夠影響胚胎質(zhì)量機制的探討.pdf

1、隨著不孕癥患者的逐年增多，對于人類輔助生殖技術(shù)(ART)來說，如何提高臨床妊娠率非常重要。而妊娠的達成需要較好的胚胎質(zhì)量和優(yōu)良的子宮環(huán)境。目前對于胚胎質(zhì)量來說，較多的評價依賴于胚胎的形態(tài)學(xué)標準，然而，依靠胚胎形態(tài)學(xué)的主觀觀察來預(yù)測妊娠結(jié)局是受限制的。最近的許多研究都集中于研究來源于卵母細胞微環(huán)境的非侵入性生物學(xué)標志物，來提高胚胎選擇的精確性。游離 DNA（cfDNA），是游離核酸的一種，為雙鏈 DNA分子，且有著比基因組 DNA更低的分

2、子量，主要來源于壞死或者凋亡的進程。最早是1948年被Mendel和Metais在血漿中發(fā)現(xiàn)。近年來被廣泛研究于腫瘤、婦產(chǎn)科等領(lǐng)域。多項研究發(fā)現(xiàn)血液中cfDNA水平在一些癌癥和嚴重疾病的患者體內(nèi)是升高的，基于此，cfDNA已經(jīng)被用于非侵入性的生物學(xué)標志物來早期診斷和判斷某些疾病的預(yù)后。而基于母體血液中胎兒cfDNA的非侵入的產(chǎn)前診斷檢測，也構(gòu)成了婦產(chǎn)科的一種很有前景的方法。目前，有研究發(fā)現(xiàn)卵泡液中的cfDNA水平與胚胎質(zhì)量存在著負相關(guān)。

3、如果卵泡液中的cfDNA含量確實與胚胎質(zhì)量存在著密不可分的關(guān)系，應(yīng)用其對胚胎質(zhì)量進行非侵入性的預(yù)測將會是一種很有前景的方法。本研究通過對卵泡液中cfDNA含量與胚胎質(zhì)量的關(guān)系探討，首先驗證了國外關(guān)于卵泡液中 cfDNA水平與胚胎質(zhì)量關(guān)系的研究，確實呈現(xiàn)負相關(guān)。進而通過cfDNA與氧化應(yīng)激及凋亡的關(guān)系，進一步探討cfDNA與胚胎質(zhì)量存在關(guān)聯(lián)性的原因。
　　目的:人卵泡液中cfDNA含量與胚胎質(zhì)量之間是否存在相關(guān)性，并探討cfDNA能

4、夠影響胚胎質(zhì)量的原因。
　　材料與方法:
　　1.實驗材料：研究選取了從2014.09-2015.02于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心行新鮮周期體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)助孕治療的189位患者，取卵日分別收集每位患者的所有卵泡液。入選患者納入標準為：1.年齡≤40歲；2.體重指數(shù)：18-25kg/m2；3.月經(jīng)周期21-35天，內(nèi)分泌正常；4.未發(fā)現(xiàn)有卵巢或子宮器質(zhì)性病變者；5.治療方案為黃體中

5、期短效長方案。剔除標準：女方不孕原因為多囊卵巢綜合癥、反復(fù)流產(chǎn)史、粘膜下層肌瘤，子宮粘連、子宮內(nèi)膜異位癥、HPV感染等的患者。
　　2.方法：①分別使用酚氯仿異丙醇法（方法A）、改良酚氯仿異丙醇法（方法B）、Qiagen試劑盒法（方法C）量化其中48份卵泡液的cfDNA含量，得出最佳檢測方法。余下的141份卵泡液選用最佳法進行檢測；②在189份卵泡液中隨機選取20份卵泡液，使用淋巴細胞分離液梯度分離出其中的顆粒細胞，將顆粒細胞隨機

6、分為四組，每組5例，分別加入不同濃度cfDNA進行共培養(yǎng)24h；③使用QRTPCR分別檢測每組氧化應(yīng)激相關(guān)因子的mRNA表達量；④使用Western-Blot檢測加入 cfDNA后不同時間段相關(guān)凋亡因子的蛋白表達量；⑤使用流式細胞儀分別檢測每組的凋亡率。
　　3.統(tǒng)計學(xué)方法：用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用t檢驗，計量資料用X2檢驗，相關(guān)分析用Spearman相關(guān)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。
　

7、　結(jié)果:
　　1.卵泡液中cfDNA提取方法比較的結(jié)果：酚氯仿異丙醇法（方法A）、改良酚氯仿異丙醇法（方法B）、Qiagen試劑盒法（方法C）這三種方法的OD值分別為(1.72±0.06)，(1.69±0.05)，（1.75±0.03），沒有明顯差異；方法 A所測得的cfDNA含量（1.518±0.095mg/ml）明顯低于方法B（1.825±0.114 mg/ml）和C（1.838±0.106mg/ml），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，方法

8、B和方法C效果相當(dāng)，沒有顯著差異，但方法C花費較之方法B昂貴。
　　2.優(yōu)胚率與cfDNA的相關(guān)性分析：優(yōu)胚率與cfDNA含量呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.865，且P＜0.05。
　　3.氧化應(yīng)激相關(guān)因子的mRAN表達量:FOXO1、TRAIL、Caspase-3、FasL、Fas五個因子的mRAN表達量隨著培養(yǎng)基中 cfDNA濃度的升高(從0mg/ml到6mg/ml)逐漸升高，且與對照組比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.

9、死亡受體途徑中相關(guān)凋亡因子的蛋白表達量：當(dāng)培養(yǎng)基中 cfDNA濃度為2mg/ml時，隨著培養(yǎng)時間增加(0h、2h、4h、8h)，活化的Caspase-8、FasL、Fas的蛋白相對表達量增加，活化的Caspase-3雖然在培養(yǎng)時間2h時，蛋白相對表達量有稍許下降，但在隨后4h、8h的檢測時，其相對表達量呈上升趨勢，且與對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.凋亡率的比較：當(dāng)在培養(yǎng)基中加入cfDNA濃度分別為0mg/ml、2mg/ml

10、、4mg/ml、6mg/ml時，共培養(yǎng)24h后，凋亡率分別為13％、24%、34%、48%，且與對照組相比，均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.改良酚氯仿異丙醇法（方法B）是三種方法中性價比最高的量化卵泡液中cfDNA的方法，而Qiagen試劑盒法是最為簡單易操作的方法。
　　2.cfDNA與優(yōu)胚率負相關(guān)，可能是由于卵泡發(fā)生過程中cfDNA導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進一步觸發(fā)顆粒細胞凋亡，使顆粒細胞凋亡率增高，卵母細胞質(zhì)量下降，