水環(huán)境游離DNA表征及其應(yīng)用探索.pdf

1、生態(tài)環(huán)境與生物多樣性研究一直都是相關(guān)領(lǐng)域關(guān)注的重點。環(huán)境DNA通常是指從環(huán)境樣本中獲取的各物種DNA的總和，因其可以快速的進行環(huán)境生物物種的鑒定而備受關(guān)注。淡水生態(tài)系統(tǒng)是人們賴以生存的重要資源之一，近年來生態(tài)環(huán)境惡化、生物多樣性減少使得淡水資源調(diào)查和水生生物物種監(jiān)測成為當前生態(tài)學相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。相對于傳統(tǒng)的物種監(jiān)測方法，環(huán)境DNA監(jiān)測具有快速、簡便、非侵入性等優(yōu)點，但物種DNA會受到水環(huán)境中各種因素的影響而出現(xiàn)較大的波動。因此針對水

2、環(huán)境中游離DNA進行系統(tǒng)的表征對于其在物種鑒定、多樣性分析和環(huán)境保護方面的研究意義重大。本論文擬重點對影響水環(huán)境游離DNA濃度的各種因素進行控制環(huán)境和自然環(huán)境的探索，并進一步應(yīng)用最新的高通量測序技術(shù)對水環(huán)境DNA進行全面檢測分析，建立系統(tǒng)的水環(huán)境DNA檢測分析平臺。為水環(huán)境DNA的深入應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。該論文的具體研究內(nèi)容如下:
　　1、水環(huán)境游離DNA的表征:
　　該論文重點進行了水環(huán)境游離DNA分離純化方法和濃度影響因素的研

3、究。首先比較了兩種常用的環(huán)境DNA提取方法，結(jié)果顯示異丙醇沉淀配合試劑盒方法獲得的水環(huán)境DNA濃度高而且穩(wěn)定，同時具有操作方便、試劑消耗少等優(yōu)點;在取樣體積的比較研究中發(fā)現(xiàn)10mL環(huán)境水樣獲得的DNA濃度能夠滿足后續(xù)研究的需求，具有很好的代表性;隨后進行的生物量、環(huán)境溫度、存在時間等對環(huán)境DNA濃度影響的研究結(jié)果表明:水環(huán)境DNA濃度隨生物量的增加而增加，具有一定的線性關(guān)系;在普通環(huán)境溫度(15-25℃)條件下，水環(huán)境DNA濃度沒有顯著

4、的變化，但是在物種被移除后，水環(huán)境DNA會逐漸減少，30天后即被完全清除，進一步研究發(fā)現(xiàn)水樣中存在微囊泡結(jié)構(gòu)包裹的DNA，這為進一步研究水環(huán)境DNA的存在狀態(tài)提供了新的方向。同時在自然環(huán)境下不同地理位置、取樣時間下環(huán)境DNA濃度也存在一定的差異。
　　2、水環(huán)境DNA的高通量檢測與應(yīng)用探索
　　論文利用高通量測序技術(shù)對南京市玄武湖水樣中DNA進行了真核微生物多樣性的探索。首先對玄武湖不同水域、不同月份的水樣進行收集，并提取水

5、環(huán)境DNA進行真核微生物18s核糖體V4可變區(qū)的PCR擴增，擴增產(chǎn)物構(gòu)建高通量測序文庫，隨后進行HiSeq2500 PE250測序與生物信息分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)玄武湖解放門附近水域，在3、4、5、6月份分別有其各自的優(yōu)勢種屬，如3月份隱藻屬(Cyptomonas)，櫛毛蟲屬(Didinium)，棕鞭藻屬(Ochromonas)，網(wǎng)甲藻屬(Woloszynskia)，擬多甲藻屬(Peridiniopsis)最為豐富，而到了4月份最優(yōu)勢種屬變成了

6、懸鈴木屬(Platanus)，杯鞭蟲屬(Bicosoeca)，根生壺菌屬(Rhizophydium)，球領(lǐng)鞭蟲(Sphaeroeca);在5、6月份頸蟲屬(Dileptus)圓纖蟲屬(Stongylidium)，擬尾蟲屬(Pseudotontonia)和管膜蟲(Cyrtohymena)，筒殼蟲(Tintinnidium)分別為豐度最高的種屬;同在五月份，湖區(qū)不同的位置亦存在一些種屬的差異。說明水環(huán)境DNA可以很好的檢測特定水域物種的分布