分子伴侶Calnexin-Calreticulin在HERG-A561V突變通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常及藥物干預(yù)中作用機(jī)制的研究.pdf

1、背景與目的: HERG基因突變引起遺傳性2型長 QT綜合征(hereditary long QT syndrome，hLQT2)，是引起青少年猝死的重要原因。HERG-A561V突變致突變蛋白被滯留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜成熟的、有功能的Ikr通道減少，從而導(dǎo)致LQT2。但截止目前，突變蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的機(jī)制尚不完全清楚。研究表明分子伴侶在蛋白質(zhì)正確折疊過程中發(fā)揮重要作用，而蛋白酶體降解系統(tǒng)在突變蛋白的降解過程中發(fā)揮重要作用。本課題旨在研究分子伴

2、侶Calnexin(CNX)/Calreticulin(CRT)是否在 HERG-A561V突變蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)異常過程中起作用，蛋白酶體抑制劑 ALLN是否可以糾正 HERG-A561V突變蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，心得安(Propranolol)治療 hLQTS是否與糾正突變蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)障礙有關(guān)，且CNX/ CRT是否在以上過程中發(fā)揮作用，以從蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)角度為 LQTS治療尋求新的靶標(biāo)提供參考。
　　方法：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 pcDNA3-WT-HERG、pc

3、DNA3-A561V-HERG、 pcDNA3-WT/A561V-HERG致 HEK-293T細(xì)胞構(gòu)建野生、突變和雜合型細(xì)胞模型；藥物ALLN及 Propranolol以終濃度10μmol/L孵育各組細(xì)胞模型24hrs和48hrs；免疫印跡、免疫共沉淀分別檢測(cè)各組間 ALLN及心得安干預(yù)前后 HERG、CNX、CRT蛋白表達(dá)的變化，HERG蛋白與 CNX、CRT結(jié)合情況；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各組hERG編碼的Ikr電流的變化情況。

4、>　　結(jié)果：免疫印跡顯示野生、雜合及突變?nèi)M間 CNX、CRT表達(dá)并無差異，但免疫共沉淀顯示分子伴侶 CNX、CRT與 A561V突變及雜合型非成熟 HERG蛋白結(jié)合增多；ALLN作用后，三組間，尤其突變及雜合組細(xì)胞膜成熟 HERG蛋白(155KD)表達(dá)明顯增多；三組間分子伴侶 CNX、CRT表達(dá)增加，且免疫共沉淀顯示 CNX、CRT與突變及雜合型 HERG蛋白結(jié)合增多明顯；膜片鉗顯示雜合型電流明顯增大，最大激活電流及尾電流的電流密度分

5、別增加70％和73%，而野生組僅輕度增大（24%，19%），突變組則均未檢測(cè)到激活電流及尾電流。Propranolol作用后，三組細(xì)胞間 HERG蛋白(155KD)、CNX、CRT表達(dá)無明顯差異，CNX、CRT與突變 HERG結(jié)合無明顯差異；膜片鉗顯示野生及雜合型細(xì)胞模型干預(yù)后激活電流及尾電流的電流密度僅輕度增大。
　　結(jié)論：分子伴侶 CNX/CRT在 HERG-A561V突變所致的突變蛋白的再折疊過程中起著重要作用,且可能與 H