萊菔硫烷對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及其抗炎機(jī)制的初步研究.pdf

1、研究背景：良好的血液供應(yīng)，是維持腦組織正常代謝和生理功能的基礎(chǔ)。腦組織細(xì)胞發(fā)生的缺血性損傷（ischemia injury）常常發(fā)生在不同原因形成的腦組織局部缺血之后。缺血組織在恢復(fù)血流灌注后，其結(jié)構(gòu)和功能的損害及代謝障礙往往還會(huì)進(jìn)一步加重。這種現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）。以缺血-再灌注損傷為主要病理改變的缺血性腦卒中具有發(fā)病率高（占腦卒中87%）,致殘率高和致死率高的特點(diǎn)

2、。給人們的健康帶來(lái)很大威脅。
　　萊菔硫烷（Sulforaphane,SFN）廣泛存在于十字花科植物如西蘭花、孢子甘藍(lán)、卷心菜中。研究表明，萊菔硫烷在抗腫瘤、抗凋亡、抗氧化以及抗炎抗菌等方面發(fā)揮著重要的作用。萊菔硫烷能通過(guò)血腦屏障，這使得它具有成為神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)的潛質(zhì)。近年來(lái)，關(guān)于萊菔硫烷在各種組織器官缺血-再灌注損傷中的作用研究也時(shí)有報(bào)道。
　　腦缺血-再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜而迅速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，其主要環(huán)節(jié)包括細(xì)胞內(nèi)

3、能量代謝障礙、鈣超載、NO合成過(guò)多、腦組織興奮性氨基酸的毒性反應(yīng)、自由基生成、線粒體功能紊亂、炎癥反應(yīng)、凋亡基因激活等。這些機(jī)制相互聯(lián)系，相互影響，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致缺血區(qū)腦組織不可逆的損傷。以往研究得較多的是氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧自由基對(duì)組織的損傷。近年來(lái)大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明炎性損傷過(guò)程在腦缺血-再灌注的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。
　　腦組織缺血階段的多種因素誘導(dǎo)炎癥因子的活化和募集，這些因素在再灌注階段又會(huì)進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的級(jí)

4、聯(lián)放大效應(yīng)，并最終導(dǎo)致腦缺血區(qū)細(xì)胞和組織的損傷。多項(xiàng)研究顯示，炎癥小體的活化對(duì)整個(gè)炎癥反應(yīng)過(guò)程的啟動(dòng)和發(fā)展起著非常重要的作用。
　　NLRP3是目前被研究得最多和最明確的NLR蛋白，它可以被多種形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子序列完全不同的模式分子活化。NLRP3炎癥小體不僅可以感應(yīng)病毒、細(xì)菌等病原微生物（PAMP)的入侵,而且可以感知多種“危險(xiǎn)信號(hào)”(DAMP)。NLRP3能夠識(shí)別相應(yīng)配體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生改變，募集并綁定pro-Caspase

5、-1。pro-Caspase-1活化為Caspase-1后將pro-IL-1β裂解為成熟的IL-1β，IL-1β作為重要的炎癥介質(zhì)，可以誘導(dǎo)其它炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，并促進(jìn)下一階段的炎性反應(yīng)。在腦缺血-再灌注過(guò)程中，由炎癥小體自身介導(dǎo)的，依賴 Caspase-1的細(xì)胞死亡―“細(xì)胞焦亡(pyroptosis)”，也是促進(jìn)缺血腦組織損傷的重要過(guò)程。
　　Janus激酶是一類非受體型胞質(zhì)內(nèi)可溶性蛋白激酶，其家族包含4個(gè)成員（JAK1-3、TKY

6、2），其中 JAK2在腦組織中的表達(dá)較其它幾種Janus激酶更高。STATs，即信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子，是JAKs的直接底物。目前 STAT家族有7個(gè)成員（STAT1-4、STAT5a、STAT5b及STAT6），其中STAT3廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
　　JAK-STAT信號(hào)通路代表的是一條極其快速的從細(xì)胞外到細(xì)胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在細(xì)胞生殖、分化、凋亡、壞死以及應(yīng)激、炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等多種生理以及病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用

7、。其中JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血-再灌注損傷過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。對(duì)缺血腦細(xì)胞的存活或死亡起著重要影響。
　　AG490是一種特異性的JAK2抑制劑，能抑制JAK2的酪氨酸磷酸化，從而抑制JAK2-STAT3信號(hào)通路的激活。目前，關(guān)于JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腦缺血-再灌注損傷的炎性反應(yīng)過(guò)程中所起作用的研究已有開(kāi)展。但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較少且實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異很大。JAK2-STAT3信號(hào)通路的激活究竟是促使損傷加重還是

8、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞目前并沒(méi)有一致的結(jié)論。JAK2-STAT3信號(hào)通路在腦缺血-再灌注損傷中的具體作用機(jī)制尚不明確。
　　綜上，本課題在建立穩(wěn)定可靠的大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型(MCAO)的基礎(chǔ)上，觀察驗(yàn)證萊菔硫烷對(duì)缺血-再灌注后腦組織損傷的保護(hù)作用，找到保護(hù)效果較好的給藥濃度和給藥時(shí)間；同時(shí)通過(guò)觀察萊菔硫烷作用后NLRP3炎癥小體及其下游炎癥介質(zhì)活化和表達(dá)情況，找到萊菔硫烷通過(guò)抗炎作用實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)功能的證據(jù)；此外，我們還通過(guò)對(duì)比萊菔

9、硫烷和AG490作用后對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路的激活及其對(duì)后續(xù)效應(yīng)的影響，對(duì)JAK2-STAT3信號(hào)通路在腦缺血-再灌注炎性反應(yīng)中的作用及萊菔硫烷與 JAK2-STAT3信號(hào)通路的關(guān)系進(jìn)行初步探討。
　　第一部分：萊菔硫烷對(duì)大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用
　　目的：
　　建立穩(wěn)定可靠的大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型(MCAO)，探討萊菔硫烷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.建立模型：采用

10、改良線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血(MCAO)模型。
　　2.分組：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，即假手術(shù)組(Sham)，模型組(MCAO)；MCAO+DMSO組；MCAO+萊菔硫烷（5mg/kg）組；MCAO+萊菔硫烷（10mg/kg）組。
　　3.檢測(cè)指標(biāo)：神經(jīng)功能癥狀評(píng)分；腦梗死體積測(cè)定；腦組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）水平檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1. MCAO模型組和MCAO+DMSO組相較假手術(shù)組，神經(jīng)功能評(píng)分明顯增高；萊

11、菔硫烷處理組可有效降低缺血-再灌注后大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分。
　　2. MCAO模型組和MCAO+DMSO組梗死體積較大，萊菔硫烷處理組可顯著縮小缺血-再灌注后大鼠的腦梗死體積。
　　3. MCAO模型組和MCAO+DMSO組相較假手術(shù)組，腦組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性明顯升高，萊菔硫烷處理組可明顯著降低缺血-再灌注后大鼠腦組織中MPO活性。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)改良的線栓法建立大鼠局灶性缺血-再灌注(MCAO

12、)模型，該模型重復(fù)性好，成功率較高，對(duì)缺血及再灌注時(shí)間控制較好，手術(shù)損傷比較小，是一種較為理想的用于研究腦缺血-再灌注損傷的模型。
　　2.萊菔硫烷可改善神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死體積，減輕缺血-再灌注后的炎癥反應(yīng)過(guò)程從而實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分：NLRP3炎癥小體在萊菔硫烷神經(jīng)保護(hù)中的作用
　　目的：
　　探討萊菔硫烷是否通過(guò)影響 NLRP3炎癥小體，影響腦缺血-再灌注過(guò)程中的炎

13、癥反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.分組：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組，即假手術(shù)組(Sham)、模型組(MCAO)、MCAO+DMSO組，MCAO+萊菔硫烷（5mg/kg）組。
　　2.檢測(cè)指標(biāo)：ELISA檢測(cè)萊菔硫烷處理后缺血腦組織中 IL-1β, IL-18的水平變化；RT-PCR檢測(cè)萊菔硫烷處理后缺血腦組織中NLRP3 mRNA水平；Western blot檢測(cè)腦萊菔硫烷處理后缺血腦組織中NLRP3、Casp

14、ase-1、IL-1β和 IL-18的蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1. MCAO和MCAO+DMSO組相較假手術(shù)組(Sham)，其NLRP3 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均增高；MCAO+SFN（5mg/kg）組NLRP3 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平較MCAO組明顯降低。
　　2. MCAO組和MCAO+DMSO組與Sham相比，Caspase-1、IL-1β和 IL-18的表達(dá)均增高，MCAO+SFN（5mg/kg

15、）組Caspase-1、IL-1β和 IL-18的表達(dá)均較MCAO組低。
　　結(jié)論：
　　1.萊菔硫烷能減少NLRP3的表達(dá)，抑制NLRP3炎癥小體的激活，使得 Caspase-1活化減少，繼而減少 Caspase-1介導(dǎo)的炎癥因子 IL-1β和IL-18的表達(dá)和分泌。
　　2.萊菔硫烷的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的激活，減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，抑制過(guò)于激烈的炎癥反應(yīng)過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　第三部分：JA

16、K2-STAT3信號(hào)通路的激活在萊菔硫烷神經(jīng)保護(hù)中的作用
　　目的：
　　探討JAK-STAT3信號(hào)通路在萊菔硫烷抗炎，抗缺血-再灌注損傷的過(guò)程中所起的作用。
　　方法：
　　1.分組：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，即假手術(shù)組(Sham)、模型組(MCAO)、MCAO+SFN組, MCAO+AG490組、MCAO+SFN+AG490組。
　　2.檢測(cè)指標(biāo)：神經(jīng)功能癥狀評(píng)分；腦梗死體積測(cè)定；腦組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）

17、水平檢測(cè)；Western blot檢測(cè)JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和 IL-18的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1. MCAO組較Sham組神經(jīng)功能評(píng)分增高，腦梗死區(qū)域明顯，MPO活性增加；應(yīng)用AG490后，即MCAO+AG490組，神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)一步增高，腦梗死區(qū)域更加明顯，MPO活性進(jìn)一步增加；MCAO+SFN組,相較MCAO組神經(jīng)功能評(píng)分降低，腦梗死體積明

18、顯減小，MPO活性減弱；MCAO+SFN+AG490組與MCAO+SFN組相比神經(jīng)功能評(píng)分升高，腦梗死體積增大，MPO活性增強(qiáng)。
　　2. MCAO組較Sham組P-JAK2、P-STAT3的水平有升高，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和 IL-18表達(dá)也增高；應(yīng)用 AG490后，即 MCAO+AG490組，P-JAK2、P-STAT3的水平降低，而NLRP3、Caspase-1、IL-1β和 IL-18表達(dá)增高。MCA

19、O+SFN組相較 MCAO組 P-JAK2、P-STAT3的水平明顯升高，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和 IL-18的表達(dá)明顯降低； MCAO+SFN+AG490組與MCAO+SFN組相比P-JAK2、P-STAT3的水平明顯降低，NLRP3、Caspase-1、IL-1β和 IL-18的表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論：
　　1.萊菔硫烷可改善神經(jīng)功能缺損，減少腦梗死體積，減輕腦缺血-再灌注后的炎癥反應(yīng)過(guò)程從而實(shí)現(xiàn)對(duì)

20、大鼠腦缺血-再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用；JAK2抑制劑AG490能減弱萊菔硫烷的這種神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2.萊菔硫烷可激活JAK2和STAT3，使P-JAK2、P-STAT3水平明顯升高，同時(shí)抑制NLRP3炎癥小體的激活，降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β和 IL-18的表達(dá)。萊菔硫烷的這一作用可被JAK2抑制劑AG490逆轉(zhuǎn)。
　　3.在腦缺血-再灌注損傷過(guò)程中，萊菔硫烷可能是通過(guò)激活JAK2-STAT3信號(hào)通路