動脈粥樣硬化T細(xì)胞克隆變化及通過let-7e調(diào)控血管內(nèi)皮功能的研究.pdf

1、論文Ⅰ動脈粥樣硬化病變中T細(xì)胞克隆變化的研究
　　1研究背景
　　動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)被認(rèn)為是有多種免疫反應(yīng)參與的慢性炎癥性疾病，主要以動脈壁的脂質(zhì)浸潤、積累以及各種炎癥免疫細(xì)胞的參與為特點(diǎn)。異常的炎癥免疫在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但其觸發(fā)機(jī)制迄今仍未完全闡明。T細(xì)胞是獲得性免疫和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控者，與動脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。在斑塊形成之前的脂質(zhì)條紋階段，淋巴T細(xì)胞已

2、存在于病灶區(qū)。
　　但是，目前對于T細(xì)胞在AS發(fā)生發(fā)展中的具體作用仍然存在一些爭論。人和小鼠的動脈斑塊中的T細(xì)胞主要是表達(dá)αβT細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)的CD4輔助性T細(xì)胞，雙敲(Apoe-/-or Ldlr-/-)的老鼠免疫缺陷可以減輕AS的發(fā)生發(fā)展，給予CD4 T細(xì)胞能逆轉(zhuǎn)免疫缺陷的抗AS作用。但是，有研究在CD4 T細(xì)胞免疫缺陷的Apoe-/-小鼠中得出了不一致的結(jié)論，發(fā)現(xiàn)給予高脂飲食后的免疫缺陷和

3、免疫狀態(tài)良好的小鼠AS的發(fā)生發(fā)展并無明顯區(qū)別。不同T淋巴細(xì)胞亞群在AS發(fā)生發(fā)展中作用的復(fù)雜性和多樣性可能是導(dǎo)致這些爭論的原因之一。這些爭論提示T細(xì)胞在AS發(fā)生發(fā)展中的作用遠(yuǎn)比人們想象的復(fù)雜，而T細(xì)胞亞群/克隆組成的多樣性和可變性是導(dǎo)致這種復(fù)雜性的主要原因之一。因此，深入的揭示AS患者T細(xì)胞的克隆構(gòu)成和變化特征可能為解答上述復(fù)雜的問題提供證據(jù)。
　　某一特定范圍的所有特異性不同的T細(xì)胞克隆的綜合，就是該范圍T細(xì)胞的免疫組庫，它的多樣

4、性和組成特征直接反應(yīng)了免疫應(yīng)答的狀態(tài)。因此，T細(xì)胞免疫組庫在很多疾病中都存在顯著異常?；诟咄繙y序的免疫組庫測序技術(shù)已開始應(yīng)用于免疫組庫研究領(lǐng)域，它以T/B淋巴細(xì)胞為研究目標(biāo)，對于多重或cDNA末端快速擴(kuò)增（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）PCR技術(shù)獲得的B細(xì)胞受體(B cell receptor，BCR)或T細(xì)胞受體(TCR)不同區(qū)域進(jìn)行高通量測序，能夠以單堿基分辨率確定數(shù)百萬種不同T或B

5、細(xì)胞克隆。這一技術(shù)使全面準(zhǔn)確的評估免疫系統(tǒng)的多樣性成為可能。
　　本研究有助于深入理解T細(xì)胞在動脈粥樣硬化性心血管疾病(Atheroscleroticcardiovascular disease，ASCVD)發(fā)生發(fā)展中的作用，揭示AS病變中炎癥免疫異常的機(jī)制。
　　2目的
　　(1)利用免疫組庫測序技術(shù)，分析AS患者外周血和斑塊內(nèi)T淋巴細(xì)胞免疫組庫的構(gòu)成和分子特征，包括克隆頻率、互補(bǔ)決定區(qū)3長度分布(Complemen

6、tdetermining region3，CDR3)、CDR3多態(tài)性、V/D/J基因利用率等;
　　(2)揭示AS患者與正常人相比，外周血和斑塊內(nèi)細(xì)胞克隆的分子類型和變化。
　　3方法
　　3.1外周血樣本和組織樣本的收取
　　收取55例符合急性冠脈綜合征(Acute coronary syndrome，ACS)診斷的病人的外周血，每例5ml，并收取56例健康人的外周血作為對照。用Ficoll密度梯度離心方法分離

7、外周血的單個(gè)核細(xì)胞。組織樣品來自尸檢標(biāo)本和有AS斑塊的標(biāo)本。
　　3.2基因組DNA的提取
　　利用離心吸附DNA技術(shù)提取純化外周單個(gè)核細(xì)胞和組織樣本的基因組DNA，從相應(yīng)分組中的每一個(gè)樣本中，收取相同量的gDNA混在一起，組成ACS外周血、正常外周血、動脈斑塊的樣本池。
　　3.3多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
　　通過多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用用于TCR-βCDR3V和J區(qū)的特異設(shè)計(jì)的引物組，從基因組DNA擴(kuò)增重排的TCR

8、-βCDR3區(qū)。
　　3.4高通量測序
　　純化多重PCR的產(chǎn)物，對DNA片段進(jìn)行文庫構(gòu)建。隨后，通過Agilent2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)評估文庫質(zhì)量（插入片段長度和文庫濃度）。橋式PCR擴(kuò)增后，在Hiseq2000測序平臺上進(jìn)行雙端101-bp測序。
　　3.5生物信息學(xué)分析
　　經(jīng)嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)過濾原始測序數(shù)據(jù)。過濾后，使用miXCR進(jìn)行序列比對，調(diào)整測序和PC

9、R引入的數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，并鑒定不同的CDR3序列及提供其表達(dá)情況的信息。該軟件還提供了CDR3區(qū)域的氨基酸序列，以及相應(yīng)讀數(shù)、插入缺失和V-D-J基因的數(shù)目和頻率。其他分析，如頻率間隔分布、累積頻率分布和VDJ利用率，使用自制腳本和Microsoft Excel軟件進(jìn)行分析。多樣性指數(shù)，包括香農(nóng)指數(shù)，辛普森指數(shù)和伯杰-帕克指數(shù)，使用BPMSG網(wǎng)站的多樣性計(jì)算器得出。
　　3.6實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)
　　通過Nan

10、odrop2000對每組純化的gDNA進(jìn)行定量。然后，使用SYBRGreen Master Mix在Bio-Rad CFX96上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。β-肌動蛋白用作內(nèi)部對照。
　　3.7數(shù)據(jù)分析
　　數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM，并使用雙尾t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行比較。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism軟件和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　4.1 T細(xì)胞克隆種類

11、和頻率分布在AS病變中顯著異常
　　在健康受試者的外周血中，氨基酸和核苷酸水平的T細(xì)胞的特異克隆類型與ACS患者的外周血和AS斑塊相比顯著增高。此外，AS斑塊中前1000位T細(xì)胞克隆的頻率顯著高于正常受試者和ACS患者的外周血中的頻率。AS斑塊中的T細(xì)胞克隆數(shù)顯著高于正常受試者和ACS患者的外周血(0.1-0.4％)。而且，較少的T細(xì)胞克隆在AS斑塊中具有較高的累積頻率。
　　4.2 T細(xì)胞克隆長度分布特征
　　在氨基

12、酸和核苷酸水平，三組的共同克隆的CDR3長度顯示正常分布。11-16個(gè)氨基酸長度的共同T細(xì)胞克隆的頻率在AS斑塊中顯著高于正常受試者和ACS患者的外周血中的頻率。此外，AS斑塊中具有某些核苷酸長度的共同T細(xì)胞克隆的頻率顯著高于其他組中的頻率。
　　4.3共同克隆分布特征分析
　　正常男性和女性外周血中共同T細(xì)胞克隆的頻率和數(shù)量相似，并且顯著高于ACS患者相應(yīng)性別的外周血中的頻率和數(shù)量。ACS男性患者外周血中共同T細(xì)胞克隆的頻

13、率分布和數(shù)量與ACS女性患者的頻率分布和數(shù)量顯著不同。此外，AS男性患者的斑塊中的共同T細(xì)胞克隆顯著升高。
　　4.4 T細(xì)胞克隆開放讀碼框分析
　　AS斑塊中的開放讀碼框內(nèi)T細(xì)胞克隆的比例顯著高于正常受試者和ACS患者外周血中的比例，而AS斑塊中的讀碼框外的T細(xì)胞克隆的比例低于其他組。
　　4.5 T細(xì)胞克隆插入和氨基酸利用率的特點(diǎn)分析
　　在所有組中T細(xì)胞克隆的TCR CDR3區(qū)域中的核苷酸插入無顯著差異，所

14、有組中T細(xì)胞的TCR CDR3插入的長度大多＜20個(gè)核苷酸。在所有三組的個(gè)體中TCR蛋白質(zhì)中20種常見氨基酸的利用率沒有顯著差異。
　　4.6 T細(xì)胞克隆多態(tài)性分析
　　AS斑塊中T細(xì)胞克隆的多樣性指數(shù)包括香農(nóng)系數(shù)、辛普森系數(shù)，伯杰-帕克指數(shù)顯著降低，表明AS斑塊的T細(xì)胞克隆的多樣性是減少的。
　　4.7 T細(xì)胞克隆VDJ基因利用率分析
　　在斑塊中T細(xì)胞的VJ基因的利用率顯著減少。AS斑塊中的高頻T細(xì)胞克隆例如

15、V20-1-J2-7和V20-1-J2-5與其他兩組相比顯著升高。AS斑塊中一些V基因（例如TRBV4-1、TRBV5-4、TRBV12-4）和J基因(例如TRBJ2-5、TRBJ2-1、TRBJ1-6)的利用率顯著不同于其他兩組。
　　4.8 AS斑塊中顯著擴(kuò)增的T細(xì)胞克隆的PCR驗(yàn)證
　　實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，ACS患者外周血中V29-1 J2-1、V20-1 J1-6、V6-3J2-7和V11-2 J2-2克隆的含量

16、或頻率顯著高于正常受試者。
　　5結(jié)論
　　(1)與正常受試者和ACS患者外周血中的T細(xì)胞克隆相比，AS患者斑塊中的T細(xì)胞克隆類型顯著降低;
　　(2)三組中不同長度CDR3區(qū)域的TCR共同克隆的頻率顯著不同。與其他兩組相比，AS斑塊組的共同克?。ㄌ貏e是高頻共同克隆）升高;
　　(3) AS斑塊的T細(xì)胞克隆多態(tài)性顯著降低，V和（或）J基因的利用率顯著降低。
　　關(guān)鍵詞:動脈粥樣硬化;T細(xì)胞受體;免疫組庫;二

17、代測序
　　論文ⅡCD4+T細(xì)胞分泌的let-7e經(jīng)細(xì)胞間相互通訊方式影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的研究
　　1研究背景
　　動脈粥樣硬化(Atheroclerosis，AS)是急性心肌梗死等嚴(yán)重心腦血管事件的主要病理基礎(chǔ)。主要特征為全身大中動脈的進(jìn)行性脂質(zhì)沉積、炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織增生。AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，但大量研究表明氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，ox

18、-LDL)是觸發(fā)血管炎癥反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮損傷，啟動AS發(fā)生的主要物質(zhì)之一。
　　Ox-LDL造成內(nèi)皮損傷的機(jī)制涉及免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的復(fù)雜信號傳遞，主要包括:1）激活T細(xì)胞等炎癥免疫細(xì)胞，通過細(xì)胞毒性作用或分泌細(xì)胞因子間接殺傷內(nèi)皮細(xì)胞;2）被內(nèi)皮細(xì)胞攝取，直接抑制其增殖和遷移，誘導(dǎo)凋亡，造成血管內(nèi)皮損傷;3）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎癥因子和粘附分子等，通過吸引炎癥免疫細(xì)胞直接作用造成內(nèi)皮損傷。目前人們已經(jīng)在單一細(xì)胞

19、中充分研究了ox-LDL的作用，但它對不同細(xì)胞間信號傳遞的影響和機(jī)制的研究還不充分。明確細(xì)胞間信號傳遞的分子，揭示ox-LDL對免疫細(xì)胞和其它細(xì)胞間通訊的作用和機(jī)制，將有助于全面理解ox-LDL和炎癥免疫在AS發(fā)生發(fā)展中的作用，為尋找有效的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。各種激素、細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)都是細(xì)胞間通信的重要信使分子，它們或者被直接分泌到細(xì)胞外，或者在微粒體和外泌體等細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)中，傳遞信號、調(diào)控相應(yīng)靶細(xì)胞的功能。研究表明除了經(jīng)典的

20、蛋白質(zhì)分子，在細(xì)胞外環(huán)境中也存在穩(wěn)定的miRNA分子（在血漿或血清中的即為循環(huán)miRNA)，這些細(xì)胞外miRNA是一類新的具有細(xì)胞間通訊功能的信號分子，能以自分泌/旁分泌的方式發(fā)揮調(diào)控作用，也能通過循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)端靶細(xì)胞，以內(nèi)分泌的方式調(diào)控靶細(xì)胞功能，是一種普遍而重要的細(xì)胞間通訊方式。
　　有研究認(rèn)為循環(huán)miRNA主要是包裝到外泌體和微粒體等胞外膜結(jié)構(gòu)中運(yùn)輸，但也有研究則認(rèn)為循環(huán)miRNA主要以核酸蛋白復(fù)合物的形式在循環(huán)中運(yùn)輸;最近有

21、研究表明循環(huán)miRNA選擇何種形式運(yùn)輸可能與miRNA的種類、細(xì)胞來源和疾病病程等有關(guān)，但關(guān)于循環(huán)miRNA如何識別并結(jié)合靶細(xì)胞的細(xì)節(jié)，以及在疾病中這一過程有何異常及其意義目前仍不清楚。這些爭論和問題說明人們對循環(huán)miRNA這種新的細(xì)胞間信號分子的功能和機(jī)制了解還很少，深入研究循環(huán)miRNA在AS發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制，對于將循環(huán)miRNA作為AS的生物標(biāo)志物和治療手段用于臨床有重要意義。
　　2目的
　　(1)尋找細(xì)胞間

22、信號傳遞分子，高通量測序方法闡述免疫CD4+T細(xì)胞分泌的外泌體中RNA種類構(gòu)成;
　　(2)研究外泌體運(yùn)輸?shù)膌et-7e在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能方面的角色，揭示ox-LDL在免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞通訊中發(fā)揮的作用和機(jī)制。
　　3方法
　　3.1 CD4+T細(xì)胞的提取及內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)
　　收取ACS患者外周血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心方法分離PBMCs，磁珠抗體分離高純度的CD4+T細(xì)胞。HUVECs細(xì)胞在ECM培養(yǎng)基，5％C

23、O2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，購買自ATCC。
　　3.2 CD4+T細(xì)胞分泌的外泌體的提取
　　Ox-LDL刺激提取的CD4+T細(xì)胞48h后，收取培養(yǎng)基，經(jīng)超速離心得到外泌體沉淀。
　　3.3實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)
　　通過RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR的方法對樣本let-7e表達(dá)水平進(jìn)行檢測，U6作為對照。
　　3.4免疫印跡(western blot)檢測
　　經(jīng)過提取總蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記

24、一抗和二抗、ECL曝光等步驟觀察目的蛋白的表達(dá)。
　　3.5高通量測序分析及數(shù)據(jù)分析
　　提取外泌體total RNA構(gòu)建RNA文庫，對文庫質(zhì)量進(jìn)行評估后，橋式PCR擴(kuò)增，在Hiseq2000測序平臺上進(jìn)行配對末端151-bp測序。經(jīng)過嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)過濾原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過組裝后，與RNA數(shù)據(jù)庫比對，鑒定不同的miRNAs和mRNAs及提供其表達(dá)情況的信息。
　　3.6免疫熒光及凋亡檢測
　　PKH-26標(biāo)記外泌體后與HUV

25、ECs共同培養(yǎng)，24h后觀察HUVECs的攝取外泌體和凋亡情況。
　　4結(jié)果
　　4.1 CD4+T細(xì)胞的分選純度
　　磁珠分選CD4+T后，流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的純度可達(dá)98％，高純度的細(xì)胞利于下一步實(shí)驗(yàn)的順利開展。
　　4.2外泌體的分泌及鑒定
　　Ox-LDL刺激CD4+T細(xì)胞后，可促進(jìn)其分泌外泌體進(jìn)入培養(yǎng)基，收取培養(yǎng)基中的外泌體，進(jìn)行電鏡檢測，發(fā)現(xiàn)顆粒處于50-100nm之間，western

26、 blot發(fā)現(xiàn)其有CD63的表達(dá)。
　　4.3外泌體RNA測序數(shù)據(jù)分析
　　測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體不僅含有眾多的miRNA，還包含著許多mRNAs和IncRNAs，對mRNA基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)，外泌體可能參與了眾多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞的凋亡、增殖、炎癥免疫等反應(yīng)。
　　4.4 CD4+T以外泌體的形式分泌let-7e
　　RNA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+T分泌的外泌體含有眾多miRNAs，其中包含了豐度值較高的let-7

27、e。而且RT-PCR發(fā)現(xiàn)與正常人的CD4+T細(xì)胞相比，AS病人的CD4+T let-7e表達(dá)量明顯升高。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，ox-LDL刺激CD4+T細(xì)胞后，其分泌的外泌體中的let-7e表達(dá)量明顯升高，說明ox-LDL能促使CD4+T細(xì)胞以外泌體形式分泌let-7e。
　　4.5 CD4+T分泌的外泌體可以被內(nèi)皮攝取影響內(nèi)皮功能
　　提取CD4+T細(xì)胞分泌的外泌體，與HUVECs共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)CD4+T分泌的外泌體可被內(nèi)皮細(xì)胞所攝取

28、，且經(jīng)過ox-LDL處理的CD4+T分泌的外泌體能夠明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　5結(jié)論
　　(1) CD4+T細(xì)胞可分泌外泌體進(jìn)入培養(yǎng)基或者血漿，它們不僅含有大量的miRNAs（包括let-7e），還包含眾多mRNAs和lncRNAs。
　　(2) ox-LDL處理CD4+T細(xì)胞后，其分泌的外泌體中包含的miRNA let-7e表達(dá)升高。
　　(3) CD4+T細(xì)胞釋放的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)let-7e進(jìn)入HUVECs，

29、并影響了內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　關(guān)鍵詞:動脈粥樣硬化;二代測序;CD4+T細(xì)胞;外泌體;let-7e
　　論文ⅢLet-7e通過ceRNA交互作用機(jī)制調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的研究
　　1研究背景
　　血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial cells，ECs)在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在炎癥刺激激活的ECs中，通過抑制抗炎細(xì)胞因子可使許多粘附分子和促炎細(xì)胞因子上調(diào)（例如ICAM1，SELE和IL-6）。過度

30、的炎癥刺激引起的內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)和許多其他心腦血管疾病發(fā)展中最重要的起始事件之一。許多細(xì)胞和分子參與ECs的炎癥反應(yīng)，但是其調(diào)節(jié)機(jī)制非常復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。
　　有研究表明miRNA可作為ECs中炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。例如，miR-146a和miR-10a可通過靶向ECs中NF-kB途徑的多種組分(TRAF6/IRA K4)抑制炎癥;miR-92a通過靶向抑制NF-kB表達(dá)的KLF

31、2/KLF4促進(jìn)ECs中的炎癥。另外，miRNA也直接靶向各種粘附分子，在活化的ECs中發(fā)揮抗炎作用，例如miR-31靶向SELE和miR-17-3p靶向ICAM1。此外， miRNA參與內(nèi)皮炎癥在眾多疾病如動脈粥樣硬化和糖尿病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，需要進(jìn)一步的研究揭示更多的miRNA及其參與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。
　　let-7家族可以通過靶向促炎因子（例如let-7d靶向IL-13; let-7a靶向IL-6）發(fā)揮抗炎作

32、用，也可以通過靶向抗炎因子例如IL-10而充當(dāng)促炎因子。另外，let-7家族與內(nèi)皮功能密切相關(guān)，包括凋亡、血管生成和內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Let-7e是let-7家族的一員，具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能和炎癥的重要功能。此外，有研究表明let-7e在包括冠心病在內(nèi)的許多心血管疾病中表達(dá)顯著增加。因此，我們推測let-7e可能通過直接或間接靶向某些炎癥基因在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。然而，到目前為止還沒有證實(shí)這種假設(shè)的研究。
　　2目的

33、r>　　(1)系統(tǒng)闡述let-7e參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的各種生物學(xué)過程;
　　(2)揭示let-7e調(diào)控內(nèi)皮功能和炎癥反應(yīng)的機(jī)制。
　　3方法
　　3.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　HUVECs細(xì)胞在ECM培養(yǎng)基，5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)50μg/ml ox-LDL處理，并在12h、24h、48h后收取細(xì)胞。
　　3.2質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　IkBβ和野生/突變體lnc-MKI67IP-3的pC

34、MV6載體和siRNA購自GenePharma和Origene。使用lipofectamine RNAIMAX或3000試劑將let-7e的模擬物/抑制劑/陰性對照(Negative control，NC)，siRNA或不同載體分別轉(zhuǎn)染到HUVEC中。
　　3.3 RNA提取
　　轉(zhuǎn)染了let-7e模擬物或抑制劑和相應(yīng)的NC的HUVECs提取total RNA，并通過Nanodrop2000分光光度計(jì)和Qubit3.0熒光計(jì)

35、定量。它們的質(zhì)量也使用Agilent2100生物分析儀進(jìn)行評估.
　　3.4芯片分析
　　總RNA用cy3標(biāo)記并與Agilent人類LncRNA4×180K微陣列雜交。將mRNAs和lncRNAs的表達(dá)數(shù)據(jù)過濾并標(biāo)準(zhǔn)化，然后使用GeneSpring GX11.5確定let-7e調(diào)節(jié)的lncRNAs和mRNAs。
　　3.5生物信息學(xué)分析
　　3.5.1功能富集分析
　　使用用于注釋，可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫

36、(DAVID) v6.7進(jìn)行功能富集分析。
　　3.5.2 let-7e潛在靶基因預(yù)測
　　Let-7e靶基因由Targetscan，MicroT-CDS和miRanda進(jìn)行預(yù)測。在let-7e模擬物組和let-7e抑制劑組中相反表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本與上述工具預(yù)測的靶基因取交集，被認(rèn)為是let-7e在HUVECs中的潛在靶基因。
　　3.5.3構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)
　　基于let-7e的預(yù)測靶點(diǎn)，使用CoExpress v1.

37、5構(gòu)建潛在地結(jié)合let-7e的lncRNAs和可能靶向let-7e的mRNAs的共表達(dá)/相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（Pearson相關(guān)系數(shù)＞0.99，P＜0.05）。然后，使用Cytoscape軟件分析其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和核心子網(wǎng)。
　　3.6實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)
　　通過RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR的方法對各樣本let-7e，pri-let-7e和mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，U6和β-actin作為對照。
　　3.7酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)EILS

38、A
　　收集的培養(yǎng)基通過ELISA試劑盒檢測ICAM1，VCAM1，SELE，SELP和IL-6的表達(dá)水平。
　　3.8免疫印跡(western blot)檢測
　　經(jīng)過提取總蛋白，胞漿蛋白和核蛋白、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、標(biāo)記一抗和二抗、ECL曝光等步驟觀察目的蛋白的表達(dá)。
　　3.9熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)
　　將IkBβ3'-UTR或lnc-MKI67IP-3中l(wèi)et-7e的靶/結(jié)合序列（或其突變體）克隆到pmirG

39、LO雙熒光素酶miRNA靶表達(dá)載體中構(gòu)建螢光素酶報(bào)道載體，分別用這些載體和let-7e模擬物/抑制劑或相應(yīng)的NC轉(zhuǎn)染HUVEC。雙熒光素酶報(bào)告測定系統(tǒng)測定樣本的螢火蟲和海腎螢光素酶活性。
　　3.10數(shù)據(jù)分析
　　使用Benjamini-Hochberg校正來校準(zhǔn)多個(gè)測試中的P值。使用自制腳本計(jì)算相關(guān)系數(shù)和P值。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM，并使用雙尾t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行比較。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R程序語言包

40、用于所有計(jì)算。
　　4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　4.1 let-7e調(diào)節(jié)的mRNAs/lncRNAs表達(dá)譜和功能富集分析
　　芯片分析結(jié)果顯示let-7e明顯影響mRNAs和lncRNAs的表達(dá)，選擇let-7e潛在靶向的385個(gè)mRNAs和let-7e潛在結(jié)合的102個(gè)lncRNAs分層聚類。let-7e模擬物抑制基因表達(dá)的作用非常明顯，而let-7e抑制劑的作用與之相反。487轉(zhuǎn)錄本的基因集富集分析顯示let-7e參與許多重要

41、的生物過程和途徑，例如免疫、細(xì)胞粘附、VEGF途徑、NF-kB/ MAPK途徑。大多數(shù)途徑與細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
　　4.2 let-7e潛在調(diào)節(jié)的共表達(dá)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)
　　基于上述487個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建共表達(dá)/相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，這個(gè)大網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治鲲@示26個(gè)重要節(jié)點(diǎn)，包括NFKBIB(IkBβ)、MAPK1、DNMT3A和TP53BP1，它們參與炎癥、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。選擇與IkBβ顯著共表達(dá)的節(jié)點(diǎn)構(gòu)成的子網(wǎng)，在這些

42、節(jié)點(diǎn)中，IkBβ和lnc-MKI67IP-3變化最顯著。
　　4.3 let-7e在內(nèi)皮細(xì)胞中的促炎作用
　　芯片數(shù)據(jù)表明let-7e可以上調(diào)HUVEC中許多關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá)，如IL-1B、IL-6、ICAM1、VCAM1、SELE和SELP，而let-7e抑制劑作用相反。此外，他們大多數(shù)都受NF-kB調(diào)節(jié)。let-7e模擬物可以顯著增加上述因子的分泌和mRNA表達(dá)，而let-7e抑制劑的作用不顯著。

43、>　　4.4 let-7e通過靶向IkBβ促進(jìn)NF-kB發(fā)揮促炎作用
　　let-7e模擬物在HUVEC中在mRNA和蛋白水平上顯著降低IkBβ表達(dá)，但let-7e抑制劑相反作用。熒光素酶活性檢測還顯示let-7e模擬物顯著降低轉(zhuǎn)染了Luc-IkBβ-VVT的HUVEC中的相對熒光素酶活性。Let-7e模擬物促進(jìn)NF-kB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中并激活。
　　4.5 Lnc-MKI67IP-3作為ceRNA抑制let-7e的促炎作用<

44、br>　　預(yù)測結(jié)果表明let-7e可以結(jié)合lnc-MKI67IP-3。螢光素酶報(bào)告檢測顯示，let-7e模擬物顯著降低了用luc-lnc-MKI67IP-3-wt轉(zhuǎn)染的HUVEC中的相對熒光素酶活性。與對照組相比，lnc-MKI67IP-3-wt載體可以減弱let-7e抑制IkBβ表達(dá)，顯著增加IkBβmRNA和蛋白的表達(dá)。此外，let-7e模擬物顯著下調(diào)lnc-MKI67IP-3表達(dá)，而let-7e抑制劑顯著上調(diào)其表達(dá)。
　　4

45、.6 let-7e在ox-LDL處理的內(nèi)皮細(xì)胞中和動脈斑塊中上調(diào)
　　ox-LDL處理HUVECs不同時(shí)間后，RT-PCR發(fā)現(xiàn)ox-LDL顯著上調(diào)let-7e和pri-let-7e的表達(dá)，而IkBβ和lnc-MKI67IP-3的表達(dá)顯著下調(diào)。此外，let-7e，IkBβ和lnc-MKI67IP-3在人動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)與ox-LDL處理的HUVEC中的表達(dá)相似。
　　5結(jié)論
　　(1)通過抑制其靶基因IkBβ，l

46、et-7e可促進(jìn)NF-kB轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核和活化，增強(qiáng)ECs中的炎癥反應(yīng)。
　　(2) let-7e通過ceRNA交互作用網(wǎng)絡(luò)機(jī)制調(diào)控NF-kB信號通路，發(fā)揮促炎調(diào)節(jié)因子的作用。
　　(3) lnc-MKI67IP-3可以拮抗let-7e對IkBβ的抑制作用，而let-7e可下調(diào)lnc-MKI67IP-3，形成正反饋加重炎癥。
　　(4) let-7e，lnc-MKI67IP-3和IkBβ在oxLDL處理的HUVEC和動脈