同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞功能參與動(dòng)脈粥樣硬化的研究.pdf

1、[目的]近年來研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈粥樣硬化是一種自身免疫性炎癥疾病,樹突狀細(xì)胞及其功能活性在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用.大量臨床和流行病學(xué)的研究已經(jīng)證實(shí)體內(nèi)同型半胱氨酸水平增高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,但目前對于同型半胱氨酸誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化形成的具體機(jī)制尚未完全明確.本研究通過觀察同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基的影響,及同型半胱氨酸激活的內(nèi)皮細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞粘附和遷移功能的作用,探討同型半胱氨酸致動(dòng)脈粥樣

2、硬化的病理機(jī)制,并為臨床防治高同型半胱氨酸血癥誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化提供科學(xué)依據(jù). [方法] (一)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離及培養(yǎng). 嚴(yán)格無菌條件下取健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)分娩的新生兒臍帶,采用膠原酶消化法分離獲得人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,加入含有15﹪胎牛血清、10ng/mL rhEGF的M 199培養(yǎng)液,置37℃,5﹪CO2孵箱培養(yǎng).第2～4代內(nèi)皮細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究. (二)人外周血單核細(xì)胞的分離純化,樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng).

3、 取新鮮的健康成人志愿者外周血,以密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞,以免疫磁珠法提純獲得CDl4+細(xì)胞,加入rhlL-4和rhGM-CSF誘導(dǎo)分化成樹突狀細(xì)胞,常規(guī)培養(yǎng)5天后收集懸浮細(xì)胞,作為未成熟樹突狀細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究. (三)實(shí)驗(yàn)分組與藥物干預(yù). 實(shí)驗(yàn)共分三大組:空白對照組(只加新鮮的M199培養(yǎng)液),Hcy組(0.01 mmol/L,0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,0.5 mmol/L和1.0

4、mmol/L),Hcy0.5+SOD組(先用SOD200U/mL預(yù)處理1h,再加Hcy 0.5 mmol/L干預(yù)24h),藥物干預(yù)24h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn). (四)免疫熒光試驗(yàn)檢測同型半胱氨酸對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基的影響. 1、內(nèi)皮細(xì)胞生長至融合,分組加藥干預(yù)24h. 2、加入分子探針hydroethidine,于37℃孵育45min. 3、立即在倒置顯微鏡下觀察,并運(yùn)用MetaMorph軟件測定目標(biāo)區(qū)域的

5、熒光強(qiáng)度. 4、每組隨機(jī)選取6個(gè)獨(dú)立的高倍鏡視野,運(yùn)用MetaMorph軟件中的Meta ImagingSeries程序計(jì)算平均熒光強(qiáng)度,代表內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基的相對量. (五)細(xì)胞粘附試驗(yàn)檢測同型半胱氨酸激活的內(nèi)皮細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞粘附功能的影響. 1、收集樹突狀細(xì)胞,并用CMFDA分子探針作熒光標(biāo)記. 2、將已標(biāo)記的樹突狀細(xì)胞與各實(shí)驗(yàn)組內(nèi)皮單細(xì)胞層于37℃共孵育. 3、共孵育1 h后吸棄上清,

6、輕柔洗去未粘附的樹突狀細(xì)胞,再加3.7﹪多聚甲醛固定20 min.4、立即在共聚焦顯微鏡下觀察樹突狀細(xì)胞的粘附情況.5、每組隨機(jī)攝取6個(gè)不同高倍鏡視野,計(jì)算每個(gè)視野中粘附的樹突狀細(xì)胞量與相應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞量的比值,得出各組樹突狀細(xì)胞粘附的平均值,以DC/EC粘附率表示,代表各組DC的粘附能力. (六)細(xì)胞遷移試驗(yàn)檢測同型半胱氨酸激活的內(nèi)皮細(xì)胞對樹突狀細(xì)胞遷移功能的影響. 1、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于Transwell板的上層小室(預(yù)先用

7、纖維連接蛋白包被),生長至融合后分組加藥干預(yù)24h. 2、將已標(biāo)記CMFDA分子探針的樹突狀細(xì)胞加于上層小室的各組內(nèi)皮單細(xì)胞層上,并在下層小室中加入含MCP-1的無血清培養(yǎng)基. 3、兩種細(xì)胞于37℃共孵育8h,停止遷移試驗(yàn). 4、立即用多功能全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測定下層小室內(nèi)細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度代表遷移樹突狀細(xì)胞的相對數(shù)量. 5、計(jì)算每組遷移的樹突狀細(xì)胞數(shù)與其對應(yīng)DC/EC粘附率的比值,以遷移指數(shù)表示,代表各