同型半胱氨酸誘導血管內(nèi)皮氧化應激調(diào)節(jié)樹突狀細胞功能參與動脈粥樣硬化的研究.pdf

1、[目的]近年來研究發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化是一種自身免疫性炎癥疾病,樹突狀細胞及其功能活性在其發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用.大量臨床和流行病學的研究已經(jīng)證實體內(nèi)同型半胱氨酸水平增高是導致動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個重要的獨立危險因素,但目前對于同型半胱氨酸誘導動脈粥樣硬化形成的具體機制尚未完全明確.本研究通過觀察同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生氧自由基的影響,及同型半胱氨酸激活的內(nèi)皮細胞對樹突狀細胞粘附和遷移功能的作用,探討同型半胱氨酸致動脈粥樣

2、硬化的病理機制,并為臨床防治高同型半胱氨酸血癥誘發(fā)的動脈粥樣硬化提供科學依據(jù). [方法] (一)人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離及培養(yǎng). 嚴格無菌條件下取健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)分娩的新生兒臍帶,采用膠原酶消化法分離獲得人臍靜脈內(nèi)皮細胞,加入含有15﹪胎牛血清、10ng/mL rhEGF的M 199培養(yǎng)液,置37℃,5﹪CO2孵箱培養(yǎng).第2～4代內(nèi)皮細胞用于本實驗研究. (二)人外周血單核細胞的分離純化,樹突狀細胞的培養(yǎng).

3、 取新鮮的健康成人志愿者外周血,以密度梯度離心法分離外周血單核細胞,以免疫磁珠法提純獲得CDl4+細胞,加入rhlL-4和rhGM-CSF誘導分化成樹突狀細胞,常規(guī)培養(yǎng)5天后收集懸浮細胞,作為未成熟樹突狀細胞用于本實驗研究. (三)實驗分組與藥物干預. 實驗共分三大組:空白對照組(只加新鮮的M199培養(yǎng)液),Hcy組(0.01 mmol/L,0.05 mmol/L,0.1 mmol/L,0.5 mmol/L和1.0

4、mmol/L),Hcy0.5+SOD組(先用SOD200U/mL預處理1h,再加Hcy 0.5 mmol/L干預24h),藥物干預24h后進行下一步實驗. (四)免疫熒光試驗檢測同型半胱氨酸對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生氧自由基的影響. 1、內(nèi)皮細胞生長至融合,分組加藥干預24h. 2、加入分子探針hydroethidine,于37℃孵育45min. 3、立即在倒置顯微鏡下觀察,并運用MetaMorph軟件測定目標區(qū)域的

5、熒光強度. 4、每組隨機選取6個獨立的高倍鏡視野,運用MetaMorph軟件中的Meta ImagingSeries程序計算平均熒光強度,代表內(nèi)皮細胞產(chǎn)生氧自由基的相對量. (五)細胞粘附試驗檢測同型半胱氨酸激活的內(nèi)皮細胞對樹突狀細胞粘附功能的影響. 1、收集樹突狀細胞,并用CMFDA分子探針作熒光標記. 2、將已標記的樹突狀細胞與各實驗組內(nèi)皮單細胞層于37℃共孵育. 3、共孵育1 h后吸棄上清,

6、輕柔洗去未粘附的樹突狀細胞,再加3.7﹪多聚甲醛固定20 min.4、立即在共聚焦顯微鏡下觀察樹突狀細胞的粘附情況.5、每組隨機攝取6個不同高倍鏡視野,計算每個視野中粘附的樹突狀細胞量與相應內(nèi)皮細胞量的比值,得出各組樹突狀細胞粘附的平均值,以DC/EC粘附率表示,代表各組DC的粘附能力. (六)細胞遷移試驗檢測同型半胱氨酸激活的內(nèi)皮細胞對樹突狀細胞遷移功能的影響. 1、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)于Transwell板的上層小室(預先用

7、纖維連接蛋白包被),生長至融合后分組加藥干預24h. 2、將已標記CMFDA分子探針的樹突狀細胞加于上層小室的各組內(nèi)皮單細胞層上,并在下層小室中加入含MCP-1的無血清培養(yǎng)基. 3、兩種細胞于37℃共孵育8h,停止遷移試驗. 4、立即用多功能全自動定量繪圖酶標儀測定下層小室內(nèi)細胞相對熒光強度代表遷移樹突狀細胞的相對數(shù)量. 5、計算每組遷移的樹突狀細胞數(shù)與其對應DC/EC粘附率的比值,以遷移指數(shù)表示,代表各