中藥復(fù)方一貫煎的代謝組學(xué)研究.pdf

1、傳統(tǒng)中醫(yī)藥已有2000多年的歷史，體現(xiàn)了淵源流長的中國文化思想及哲學(xué)理念。代謝組學(xué)理論的提出為中藥現(xiàn)代化研究提供了很好的發(fā)展契機(jī)。通過定性、定量描述生物體受外界因素刺激或擾動后內(nèi)源性代謝物組的變化規(guī)律與方向，代謝組學(xué)可能揭示與表述生命活動的生物學(xué)活動本質(zhì)。在近年的時間內(nèi)獲得中醫(yī)藥界的廣泛重視尤其在中藥藥效學(xué)、安全性評價及生命科學(xué)領(lǐng)域得到了空前的發(fā)展。
　　中藥復(fù)方一貫煎由生地黃、麥冬、北沙參、枸杞、當(dāng)歸、川楝子六味中藥組成，出自清

2、代醫(yī)家魏之秀的《續(xù)名醫(yī)類案》，主治：“脅痛，吞酸，吐酸，疝瘕，一切肝病?！睆埳嚼自凇吨酗L(fēng)斠詮》卷3：“以調(diào)肝氣之橫逆，順其調(diào)達(dá)之性，是為涵養(yǎng)肝陰第一良藥”有疏肝瀉熱，活血止痛消炎的臨床效果。方中重用生地黃養(yǎng)血滋陰、柔肝疏郁、補(bǔ)脾助益肝腎為君藥，內(nèi)寓滋水涵木之意。當(dāng)歸、枸杞養(yǎng)血滋陰疏肝；麥冬、北沙參養(yǎng)陰生津，滋養(yǎng)肺胃，意在佐金平木，扶土制木，四藥同為臣藥。佐少量川楝子，疏肝理氣，泄熱止痛，復(fù)其條達(dá)之性。該藥性雖苦寒，若與若干甘寒養(yǎng)血滋陰藥

3、物配伍，則失苦燥傷陰之弊端。六者配伍從化學(xué)本質(zhì)上講是中藥物質(zhì)多組份間組成的一個系統(tǒng)的、龐大的互相作用體系，是復(fù)方發(fā)揮整體效應(yīng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。國內(nèi)對一貫煎水煎液的研究主要是復(fù)方配伍，藥物配比，制劑方面的研究，然而對一貫煎治療機(jī)制的探索方面尚不十分明確。
　　為了探索一貫煎在治療過程中的作用機(jī)制及代謝通路，本研究利用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，尋找濃度或豐度改變顯著的模型差異性代謝

4、物，通過鑒定代謝物的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建相關(guān)疾病模型體內(nèi)代謝輪廓與疾病代謝表型關(guān)系的代謝網(wǎng)絡(luò)，從代謝物水平上揭示一貫煎復(fù)方的水提液對調(diào)控抗炎、抗疲勞及抗肝纖維化作用機(jī)制的影響。
　　具體的研究結(jié)果如下：
　　一、基于代謝組學(xué)方法的研究一貫煎抗炎機(jī)制
　　為探索一貫煎在治療炎癥過程中對生物體內(nèi)炎癥機(jī)制的調(diào)節(jié)作用。在觀察一貫煎對角叉菜膠致大鼠足腫脹模型及二甲苯致小鼠耳腫脹模型的抗炎效果，然后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測量一貫煎

5、對大鼠血清內(nèi)白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）的等致炎因子含量的變化。本研究采用了LC/MS及GC/MS技術(shù)，進(jìn)行代謝組學(xué)分析，然后將在MS2 Scan及Scan模式獲得的譜圖上傳至XCMSonline對譜峰進(jìn)行基線校正、峰識別與峰對齊、保留時間校正導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)矩陣，并導(dǎo)入SIMCA-P11.5進(jìn)行PCA及PLS-DA分析，篩選出與炎癥相關(guān)的差異性代謝物。在基于LC-MS分析的角叉菜膠致

6、大鼠足趾腫脹實驗?zāi)Ｐ椭泻Y選出25差異性代謝物，分別有：尿液中有精胺、琥珀酸、乙酰乙酸、黃尿酸、馬尿酸、肌酸、檸檬酸、2-酮戊二酸、馬尿酸、鵝肌肽、胍基乙酸等，血清中組胺、肌肽、脯氨酸、?；撬?、苯丙酮酸、半胱氨酸、色氨酸、膽堿、花生四烯酸、乙酰膽堿等；在基于GC-MS分析的二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型中篩選出14個差異性代謝物，分別有：鵝肌肽、磷酸絲氨酸、琥珀酸、亞油酸、檸檬酸、甘氨酸、丙酮酸，草酰乙酸，2-氧化戊二酸、尿嘧啶、亞精胺、乙酸、

7、乳酸等。再通過MetPA進(jìn)行相關(guān)的代謝通路的富集，找出impact>0.1的相關(guān)代謝通路，最后進(jìn)行代謝網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，利用標(biāo)志物或代謝網(wǎng)絡(luò)簡單闡釋作用機(jī)制。
　　二、基于代謝組學(xué)方法的一貫煎水煎液對小鼠抗疲勞的作用機(jī)制研究
　　為了解一貫煎對疲勞小鼠內(nèi)源代謝物變化，探索在治療過程中對生物體抗疲勞代謝通路的影響，本研究采用GC-MS及多元統(tǒng)計分析技術(shù)，運(yùn)用代謝組學(xué)研究方法，通過建立小鼠尾部負(fù)重游泳實驗致疲勞模型，測定小鼠血清內(nèi)物

8、質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)并篩選與抗疲勞相關(guān)的生物標(biāo)記物，推測與抗疲勞相關(guān)的作用機(jī)制。將Scan模式下采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入XCMSonline后導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)矩陣，并導(dǎo)入至SIMCA-P11.5進(jìn)行PCA及PLS-DA分析，篩選出與炎癥相關(guān)的差異性代謝物。篩選出的差異性代謝物分別為L-2-氨基-乙酰乙酸、?；撬?、富馬酸、蘋果酸、天門冬氨酸、馬尿酸、草乙酸、谷氨酰胺、甘氨酸、絲氨酸、尿素等，通過MetPA/MBrole進(jìn)行代謝通路富集，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)行一貫煎

9、的抗疲勞作用機(jī)制解釋。一貫煎藥理學(xué)實驗表明，能提高小鼠游泳持續(xù)時間，降低BUN, BLA水平，增加SOD水平，具有抗疲勞作用，并觀察到差異性代謝物如某些氨基酸、有機(jī)酸、糖類等的含量能在紊亂的機(jī)體內(nèi)由于一貫煎的干預(yù)而向正常組轉(zhuǎn)歸，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗疲勞作用。
　　三、基于代謝組學(xué)的一貫煎水煎液對小鼠抗肝纖維化的作用機(jī)制研究
　　采取LC/MS分析技術(shù)，運(yùn)用代謝組學(xué)研究方法，檢測肝纖維化大鼠的陰虛證表征，觀察滋補(bǔ)肝腎中藥一貫煎對陰

10、虛證表征的影響。將60只雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機(jī)分為6組：正常對照組、模型組、陽性組、一貫煎高劑量組（21.56g/kg）、中劑量組（10.78g/kg）、低劑量組（5.39g/kg）每組10只。除正常對照組外其余每組均建立CCl4致大鼠肝纖維化模型，在CCl4停止給藥后3d，一貫煎組每只動物給予相應(yīng)濃度的一貫煎水煎液給予灌胃，1次/d，陽性組則給予灌胃秋水仙堿0.25 mg/kg，1次/d，正常對照組及模型組按灌服等量

11、生理鹽水。6周后檢測各組大鼠尿液及血清的代謝物輪廓，通過HE染色評價纖維化程度。利用Metaboanalyst進(jìn)行PCA及PLS-DA分析并篩選出差異性代謝物，進(jìn)行代謝物輪廓分析。給藥組的肝組織切片呈明顯的恢復(fù)狀態(tài)，血清及尿液代謝軌跡逐漸偏向正常組，定性鑒定出14種潛在代謝生物標(biāo)志物，通過MetPA通路分析，找到4條肝纖維化代謝通路。得出一貫煎具有顯著地抗肝纖維化作用。
　　綜上分析，一貫煎參與的疾病調(diào)節(jié)機(jī)制涵蓋了機(jī)體多個系統(tǒng)器官