成人原代肝細胞培養(yǎng)及凍存復蘇后細胞凋亡的Annexin V-PI檢測及Fas表達.pdf

1、目的:研究成人原代肝細胞分離后及凍存復蘇后培養(yǎng)過程中肝細胞凋亡情況，探討成人原代肝細胞體外長期保存的凋亡特點。
　　方法:選取手術(shù)切除的成人良性病變肝葉標本，采用改良膠原酶灌注分離法分離肝細胞，加用凍存保護液對肝細胞進行凍存;用血球計數(shù)板計數(shù)法對分離后及凍存復蘇后的肝細胞進行計數(shù)，用臺盼藍拒染法及流式細胞儀活細胞熒光染色法(FACS)檢測肝細胞活力;體外培養(yǎng)新鮮分離及凍存復蘇后的肝細胞，分別在培養(yǎng)的第1d、2d、3d、5d、7d、

2、9d采用AnnexinⅤ/PI雙染色法對肝細胞進行熒光染色，通過熒光顯微鏡觀察及流式細胞儀檢測培養(yǎng)過程中肝細胞凋亡情況;在新鮮分離的肝細胞體外培養(yǎng)的第1d、2d、3d、5d、7d、9d天，運用細胞免疫組化技術(shù)檢測肝細胞Fas表達情況。
　　結(jié)果:1.新鮮分離與凍存復蘇后的成人原代肝細胞在形態(tài)上無明顯差別;2.采用改良膠原酶灌注分離法分離的肝細胞總數(shù)可達109個以上;3.用胎盤藍拒染法、流式細胞儀活細胞熒光染色法(FACS)測定新鮮

3、分離的成人原代肝細胞活率分別為92.7％、93.30％，加用凍存保護液凍存復蘇后的肝細胞活率分別為80.6％、81.24％;4.采用AnnexinⅤ/PI雙染色法檢測新鮮分離培養(yǎng)的成人原代肝細胞，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡數(shù)隨培養(yǎng)時間逐漸增多，并且在培養(yǎng)第3天后顯著增加;5.AnnexinⅤ/PI流式細胞分析法檢測新鮮分離及凍存復蘇后培養(yǎng)過程中肝細胞的凋亡情況，隨時間推移，早期凋亡率及總凋亡率逐漸增高，新鮮分離培養(yǎng)的肝細胞在培養(yǎng)前3天凋亡率

4、增幅不明顯(P＞0.05)，培養(yǎng)第3天后凋亡率增幅顯著增高(P＜0.05)，凍存復蘇后培養(yǎng)的肝細胞在培養(yǎng)第2天后凋亡率增幅顯著增高(P＜0.05);6.細胞免疫組化檢測新鮮分離培養(yǎng)的肝細胞Fas表達顯示，在成人原代肝細胞培養(yǎng)過程中，前3天Fas表達量無顯著性差異(P＞0.05)，在培養(yǎng)第3天后顯著升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.改良膠原酶灌注分離法分離成人原代肝細胞操作簡單、耗時短，獲取的肝細胞數(shù)量、純度及活率高