枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b抑制小鼠腎癌細胞生長及其機制研究.pdf

1、第一部分枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b抑制小鼠腎癌細胞生長的體外實驗
　　目的：
　　探討枸杞多糖、干擾素 a2b在體外是否能抑制小鼠腎癌 Renca細胞的生長，明確枸杞多糖聯(lián)合干擾素 a2b治療 Renca細胞的最佳濃度和作用時間，探索其潛在的作用機制。
　　方法：
　　1. MTT法檢測不同濃度的枸杞多糖(50,100,200和400μg/ml)和干擾素a2b(1,000,2,000,4,000,和8,000 IU

2、/ml)作用Renca細胞24h、48h和72h對細胞活力的影響。
　　2. MTT法檢最佳濃度枸杞多糖(200μg/ml)聯(lián)合干擾素a2b(4,000 IU/ml)作用Renca細胞24h、48h和72h對細胞活力的影響，篩選枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b最佳的作用時間。
　　3.流式細胞術(shù)檢測枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b作用48h對Renca細胞凋亡的影響。
　　4.流式細胞術(shù)檢測枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b作用48h對Renc

3、a細胞細胞周期分布的影響。
　　5. Western blot檢測枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b作用48h對Renca細胞蛋白Bcl-2、Bax、cyclin D1和c-Myc表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1. MTT結(jié)果顯示：枸杞多糖（濃度為200μg/ml）和干擾素a2b（濃度為4,000IU/ml）單獨作用48h對Renca細胞活力影響最大，在此濃度和時間范圍以內(nèi)，枸杞多糖、干擾素 a2b呈劑量和時間依賴性地降低Ren

4、ca細胞活力。
　　2.枸杞多糖（濃度為200μg/ml）聯(lián)合擾素a2b（濃度為4,000IU/ml）作用48h降低Renca細胞活力最明顯，在48h內(nèi)呈時間依賴性地降低Renca細胞活力。
　　3.與對照組、枸杞多糖和干擾素α2 b單獨運用誘導(dǎo)Renca細胞凋亡的百分比(分別為5.42％±0.86%，34.21%±1.43%，23.15%±1.56%）比較，枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2 b（56.21%±1.32%)誘導(dǎo)Renc

5、a細胞凋亡的比例顯著增加，且主要為晚期凋亡，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　4.與對照組、枸杞多糖和干擾素α2 b單獨運用誘導(dǎo)Renca細胞阻滯于 G0/G1期的百分比（分別為35.44%±0.97%，57.09%±0.29%，47.61%±0.36%）比較，枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b（67.81%±0.50%)誘導(dǎo)Renca細胞阻滯于 G0/G1期的比例顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且枸杞多糖聯(lián)合干擾素α

6、2b誘導(dǎo)Renca細胞阻滯于S期的百分比（21.10%±0.46%）顯著減少（P<0.01）。
　　5.與對照組比較，枸杞多糖、干擾素α2b單獨和聯(lián)合運用均能顯著增加Renca細胞促凋亡蛋白Bax表達（P<0.01），顯著降低降低抑凋亡蛋白Bcl-2和細胞增殖蛋白c-Myc表達（P<0.01）；與干擾素α2b單獨運用組比較，枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b更顯著下調(diào)蛋白 Bcl-2、cyclin D1和 c-Myc表達（P<0.01），上

7、調(diào)蛋白Bax表達（P<0.01）；而杞多糖、干擾素α2b單獨運用組在降低蛋白 Bcl-2和增加蛋白 Bax表達無顯著差異（P>0.05）；單獨運用枸杞多糖組較單獨運用干擾素α2b組降低降低蛋白Bcl-2、cyclin D1和 c-Myc表達更顯著（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.枸杞多糖、干擾素a2b在體外均能降低腎癌Renca細胞活力，本次試驗中最佳作用濃度分別為200μg/ml和4,000IU/ml，最佳作用時間為

8、48h；枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b作用Renca細胞48h降低細胞活力最明顯。
　　2.枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b誘導(dǎo)腎癌Renca細胞凋亡，且主要為晚期凋亡；誘導(dǎo)Renca細胞阻滯在 G0/G1期，減少S期細胞的百分比。
　　3.枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b誘導(dǎo)腎癌Renca細胞增殖蛋白c-Myc、抑凋亡蛋白Bcl-2和細胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1表達下調(diào)，促進促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)，促進Renca細胞凋亡，抑制其增殖。<

9、br>　　第二部分枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b在體內(nèi)抑制小鼠腎癌細胞的生長
　　目的：
　　探討枸杞多糖聯(lián)合干擾素 a2b在體內(nèi)是否能抑制腎癌 Renca細胞生長。
　　方法：
　　1.將36只6周齡雄性BALB/c小鼠每只左側(cè)肋部皮下注射1.5×106 Renca細胞懸液，建立腎癌移植瘤模型，每周監(jiān)測各組小鼠體重、腫瘤體積2次。
　　2.當(dāng)移植瘤長到40-50mm3時，將36只BALB/c荷瘤小鼠隨機分為4組

10、（每組9只）：對照組、干擾素a2b組、枸杞多糖組、枸杞多糖聯(lián)合干擾素 a2b組。對照組予每只小鼠腹腔注射無菌 PBS100μl，2次/周；無菌PBS100μl灌胃，1次/天；干擾素a2b組予腹腔注射干擾素a2b200 IU，2次/周；無菌PBS100μl灌胃，1次/天；枸杞多糖組予腹腔注射無菌PBS100μl，2次/周；枸杞多糖20μg灌胃，1次/天；枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b組予腹腔注射干擾素a2b200 IU/只，2次/周；枸杞多糖2

11、0μg灌胃，1次/日；連續(xù)2周，每周監(jiān)測各組小鼠體重、腫瘤體積2次。
　　3.枸杞多糖、干擾素a2b干預(yù)荷瘤小鼠2周后處理小鼠，切取移植瘤作HE染色以鑒定建模是否成功。
　　4．免疫組織化學(xué)分析枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b對荷瘤小鼠移植瘤中抑凋亡蛋白的的影響。
　　結(jié)果：
　　1.移植瘤 HE染色顯示：腫瘤組織中細胞大小不均，形態(tài)不一，排列紊亂；細胞核增大，核質(zhì)比例失常，核深染，異常核分裂，說明成功建立小鼠腎癌移植瘤

12、模型。
　　2.與對照組、枸杞多糖組、干擾素a2b組比較，枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b治療能顯著降低移植瘤的體積（P<0.01）和重量（P<0.01），而枸杞多糖、干擾素 a2b單獨運用組間移植瘤的體積和重量無顯著變化（P>0.05）。
　　3.免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示：取5個高倍視野，平均每個視野 Bcl-2陽性腎癌細胞數(shù)量百分比，對照組為（67.9%±4.2%）、干擾素α2b組（68.7%±3.3%）、枸杞多糖組（66.1%

13、±2.4%）、枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b組（65.2%±1.9%），各組間抑凋亡蛋白 Bcl-2陽性表達率無顯著差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b在體內(nèi)能抑制小鼠腎癌Renca細胞的生長。
　　2.枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b對腎癌荷瘤小鼠移植瘤抑凋亡蛋白Bcl-2表達的無明顯影響。
　　第三部分枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b抑制腎癌細胞分泌exosomes及其蛋白表達的體外實驗
　　

14、目的：
　　探討枸杞多糖聯(lián)合干擾素 a2b在體外對腎癌 Renca細胞分泌exosomes及其蛋白表達的影響
　　方法：
　　1．復(fù)溫枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b作用Renca細胞后收集的上清液。2.超濾加蔗糖重水密度梯度離心法提取 Renca細胞上清液中exosomes。
　　3.透射電鏡鑒定枸杞多糖和干擾素α2b干預(yù)Renca細胞后exosomes形態(tài)及數(shù)量的變化
　　4. Western blot檢測枸杞

15、多糖聯(lián)合干擾素α2b對Renca細胞分泌exosomes及其蛋白HSP70和G250表達的影響。
　　結(jié)果：
　　1.枸杞多糖、干擾素a2b單獨或聯(lián)合處理Renca細胞后，透射電鏡觀察各組Renca細胞分泌的exosomes形態(tài)無顯著變化（P>0.05）；而枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b處理組分泌exosomes數(shù)量較對照組和單獨處理組顯著減少（P<0.05）。
　　2.枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b處理Renca細胞后分泌的ex

16、osomes蛋白HSP70、G250表達水平顯著降低( P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.枸杞多糖聯(lián)合干擾素α2b在體外能減少腎癌Renca細胞分泌exosomes數(shù)量，分泌的exosomes形態(tài)無顯著變化。
　　2.枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b能顯著降低腎癌Renca細胞分泌的exosomes蛋白HSP70、G250的表達。
　　第四部分枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b在體內(nèi)對腎癌荷瘤小鼠 MDSCs、CD4/CD8

17、T淋巴細胞比例的影響
　　目的：
　　探討枸杞多糖聯(lián)合干擾素 a2b體內(nèi)對腎癌荷瘤小鼠 MDSCs、CD4/CD8 T淋巴細胞比例的影響。
　　方法：
　　1.在第二部分研究中，枸杞多糖、干擾素a2b治療荷瘤小鼠2周后處理各組小鼠，提取小鼠雙側(cè)股骨/脛骨骨髓細胞，流式細胞術(shù)檢測各組小鼠骨髓中MDSCs比例。
　　2.在第二部分研究中，枸杞多糖、干擾素a2b治療荷瘤小鼠2周后處理各組小鼠，提取小鼠脾臟，流式細

18、胞術(shù)檢測各組小鼠脾臟CD4/CD8T淋巴細胞比例。
　　結(jié)果：
　　1.流式細胞術(shù)檢測顯示:與對照組MDSCs百分比（47.65%±0.25%）比較，干擾素組 a2b（37.7%±0.50%）、枸杞多糖組（37.1%±0.41%）和枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b組（30.1%±1.01%）顯著減少荷瘤小鼠骨髓中MDSCs比例（P<0.05），以枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b組減少更明顯（P<0.01）；與枸杞多糖和干擾素a2b單獨處理組

19、比較，枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b組MDSCs比例顯著減少（P<0.05）；而枸杞多糖和干擾素a2b單獨處理組間比較，MDSCs比例無顯著差別（P>0.05）。
　　2.流式細胞術(shù)檢測顯示：與對照組CD4/CD8 T淋巴細胞比例（1.25%±0.12%）比較，干擾素a2b組（1.87%±0.14%）、枸杞多糖組（1.95%±0.21%）和枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b組（2.21%±0.23%）均能顯著升高荷瘤小鼠CD4/CD8 T淋巴細胞

20、比例（P<0.05），以枸杞多糖聯(lián)合干擾素 a2b組增高更明顯（P<0.01）。而枸杞多糖和干擾素 a2b單獨處理組間比較，CD4/CD8 T淋巴細胞比例增高不明顯（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.枸杞多糖聯(lián)合干擾素 a2b在體內(nèi)能降低腎癌荷瘤小鼠骨髓中MDSCs的比例，這可能是枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b減少MDSCs的活化、增殖，減輕免疫抑制作用，進而抑制腎癌Renca細胞生長。
　　2.杞多糖聯(lián)合干擾素a2b在

21、體內(nèi)能增加荷瘤小鼠脾臟CD4/CD8 T淋巴細胞比例，這可能是枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b增強機體及T淋巴細胞免疫功能，或提高免疫細胞對腎癌特異性抗原的敏感性，促進細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺滅作用，抑制腫瘤生長。
　　第五部分腎癌細胞來源exosomes在體內(nèi)活化MDSCs的實驗研究
　　目的：
　　探討腎癌Renca細胞來源exosomes在體內(nèi)是否能活化MDSCs。
　　方法：
　　1.將54只6周齡

22、雄性BALB/c小鼠隨機分為3組：生理鹽水組（對照組）、exosomes組和Renca細胞組。生理鹽水組每只小鼠左側(cè)肋部皮下注射100μl生理鹽水； exosomes組每只小鼠尾靜脈內(nèi)注射100μg腎癌Renca細胞來源exosomes溶液；Renca細胞組每只小鼠左側(cè)肋部皮下注射1.5×106 Renca細胞溶液建立小鼠實驗?zāi)Ｐ?。每周監(jiān)測各組小鼠體重和Renca細胞組腫瘤體積2次。
　　2.分別在建模后第10天、20天和30天處

23、死生理鹽水組、exosomes組和Renca細胞組小鼠各6只，按照前述方法提取小鼠雙側(cè)股骨/脛骨骨髓細胞，采用流式細胞術(shù)檢測生理鹽水組、exosomes組和Renca細胞組小鼠骨髓中MDSCs比例。
　　3.在建模后第10天、20天和30天處死Renca細胞組小鼠后，切下移植瘤作HE染色。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立BALB/c小鼠實驗?zāi)Ｐ汀?br>　　2.在建模后第10天處理三組小鼠各6只，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：

24、與生理鹽水組 MDSCs百分比（22.31%±1.15%）比較，exosomes組（31.15%±0.83%）和 Renca細胞組（32.85%±1.32%）小鼠骨髓的MDSCs比例顯著增高（P<0.05）；而exosomes組與Renca細胞組比較， MDSCs比例無顯著差異，無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。第20天同法處理顯示:與生理鹽水組（25.56%±0.36%）比較， exosomes組（40.15%±0.26%）和Renca細

25、胞組（41.85%±0.56%）的MDSCs比例顯著增高。第30天同法處理結(jié)果顯示：與生理鹽水組（25.67%±0.41%）比較，exosomes組（41.23%±0.30%）和Renca細胞組（41.95%±0.42%）的MDSCs比例顯著增高。在exosomes組與Renca細胞組內(nèi)，第20天和30天比第10天要顯著增加MDSCs比例，有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。而生理鹽水組MDSCs比例在第10、20和30天之間比較無顯著差異。

26、
　　結(jié)論：
　　腎癌Renca細胞來源exosomes在體內(nèi)能活化小鼠骨髓MDSCs，促進其增值。
　　第六部分腎癌細胞來源exosomes膜結(jié)合型HSP70在體外活化MDSCs及其機制研究
　　目的：
　　探討腎癌 Renca細胞來源 exosomes膜結(jié)合型 HSP70在體外活化MDSCs及其機制。
　　方法：
　　1.提取第四部分研究中 exosomes組及 Renca細胞組小鼠股骨/脛

27、骨骨髓細胞,按照流式細胞分選和免疫磁珠細胞分選說明書操作分選MDSCs。
　　2.將分選得到的MDSCs2000 rpm離心7min，用含有10%進口胎牛血清、100 U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸，接種于用0.1mg/ml多聚賴氨酸包被的細胞培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2條件下原代培養(yǎng)，隔天換液一次，鏡下觀察MDSCs形態(tài)，當(dāng)瓶底細胞融合到90%時，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。
　　3.免疫熒光技

28、術(shù)檢測原代培養(yǎng)的貼壁MDSCs，激光共聚焦技術(shù)檢測懸浮MDSCs。
　　4.將原代培養(yǎng)的MDSCs設(shè)立MDSCs組、MDSCs+exosomes組、MDSCs+exosomes+HSP70抑制劑組和MDSC+exosomes+抗TLR-2抗體組。 MDSCs組加DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，MDSCs+exosomes組加入20μg exosomes共培養(yǎng)，MDSCs+exosomes+HSP70抑制劑組加入20μg exosom

29、es和4μg HSP70抑制劑Pifithrin-μ共培養(yǎng)，MDSCs+exosomes+抗TLR-2抗體組加入20μg exosomes和3μg抗TLR-2抗體共培養(yǎng)24h；然后用Western blot檢測各組MDSCs中蛋白TLR2、MyD88、TRAF6、p38、p-p38和AP-1表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.免疫磁珠細胞分選 MDSCs較流式細胞分選陽性率更高，在后續(xù)實驗中選擇免疫磁珠分選MDSCs。
　

30、　2.免疫熒光檢測顯示MDSCs有貼壁生長方式，激光共聚焦檢測顯示MDSCs也有懸浮生長方式；MDSCs在原代培養(yǎng)的過程中會發(fā)生分化，在傳3代后Gr-1、CD11b雙陽性標(biāo)記的MDSCs數(shù)量減少。
　　3. Western blot結(jié)果顯示：與MDSCs組比較， MDSCs+exosomes組中蛋白TLR2、MyD88、TRAF6、p38、p-p38及AP-1表達水平顯著上調(diào)（P<0.01）。與MDSCs+exosomes組比較，

31、MDSCs+exosomes+HSP70抑制劑組中蛋白MyD88、TRAF6、p38、p-p38及AP-1表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）；而MDSCs+exosomes+抗TLR-2抗體組中蛋白MyD88、TRAF6、p-p38表達水平顯著下調(diào)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.免疫磁珠分選MDSCs比流式細胞分選法效果好。
　　2. MDSCs在體外原代培養(yǎng)過程中有貼壁和懸浮兩種生長方式，還會發(fā)生分化。

32、　　3.腎癌Renca細胞來源exosomes在體外參與了小鼠骨髓MDSCs的活化，其機制可能是 exosomes膜結(jié)合型 HSP70通過 TLR2/M-yD88/TRAF6/P38/AP-1信號通路活化MDSCs，促進MDSCs增殖，同時由于 exosomes成分的復(fù)雜性，有可能通過其它信號通路同時激活MDSCs。因此，枸杞多糖聯(lián)合干擾素a2b可通過減少腎癌Renca細胞分泌exosomes，降低exosomes膜結(jié)合型HSP70的表