結(jié)核桿菌噬菌體D29 LysinB的克隆表達、純化及活性分析.pdf

1、結(jié)核病是危害人類健康的重大傳染病,由于結(jié)核桿菌多重耐藥菌株的出現(xiàn),使得結(jié)核病的防治形勢日益嚴峻,尋找和研發(fā)新型抗結(jié)核藥物以縮短治療時間和殺死耐多藥與嚴重耐多藥結(jié)核桿菌勢在必行。這些新藥物需具有以下幾個特點：(1)高效的抗結(jié)核菌活性。(2)對耐多藥結(jié)核菌株有殺滅作用。(3)不會產(chǎn)生副作用且不會產(chǎn)生耐藥性菌株。
　　 噬菌體的發(fā)現(xiàn)和噬菌體裂解酶的研究為感染耐藥結(jié)核桿菌的治療帶來了希望。目前,國內(nèi)外對結(jié)核桿菌噬菌體裂解酶的研究還處于起

2、步階段。雖然有些噬菌體的裂解酶基因組序列已被破譯,但它們的裂解酶基因尚未發(fā)現(xiàn)。噬菌體D29是一種烈性噬菌體,能裂解結(jié)核分支桿菌和恥垢分支桿菌。氨基酸序列分析表明D29的LysB(gp12)與Ms6的LysB同源性為43％。噬菌體D29的LysB不僅具有分解脂肪的活性,還是一種新型的分支菌酸?；⒗肴樘酋ッ?它能裂解分支菌酸?；⒗肴樘沁B接鍵并釋放出游離的分支菌酸,對于輔助內(nèi)溶素實現(xiàn)對分支桿菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面發(fā)揮

3、著重要的作用。鑒于此,我們克隆表達了噬菌體D29 LysB蛋白,對蛋白的表達條件進行優(yōu)化,測定表達蛋白的脂肪酶活性,研究酶活的最佳溫度、最佳pH以及熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,初步分析了其酶學(xué)性質(zhì)。本課題研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建克隆及表達載體實現(xiàn)目的蛋白的表達:首先以噬菌體D29基因組為模板,采用PCR方法擴增lysB基因,構(gòu)建pMD-lysB克隆載體轉(zhuǎn)化進入E.coli DH5a完成lvsB基因的克隆?？寺『蟮膌y

4、sB基因雙酶切后與載體pET22b連接,得到表達載體pET22b—lysB。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入E coli BL21(DE3)中,IPTG誘導(dǎo)即可實現(xiàn)目的蛋白的表達。
　　 2.優(yōu)化蛋白表達條件及重組蛋白的純化:蛋白可溶性分析表明,部分重組蛋白是可溶性的。通過對IPTG濃度和誘導(dǎo)時間的優(yōu)化,確定出表達最佳條件為:25℃,IPTG終濃度為0.05mM條件下誘導(dǎo)10h。在此條件下,SDS—PAGE薄層掃描分析顯示重組蛋白(His—L

5、ysB)約占全菌總蛋白的50％以上,重組蛋白(His—LysB)大部分是可溶性的,占全菌可溶性總蛋白的48.1％。采用鎳柱親和層析(Ni—NTA)純化了可溶性表達產(chǎn)物,純化后的重組蛋白純度大于85％,經(jīng)濃縮透析后測定蛋白濃度為3.7 g／L,從1 L的LB培養(yǎng)物中可獲得33.2 mg高純度His—LysB。
　　 3.重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)研究:經(jīng)Ni-NTA純化后的重組蛋白在分別含有Tween80和Tween20的LB平板上呈現(xiàn)出分

6、解脂肪的活性,說明該蛋白屬于脂肪酶。以pNPB為底物,研究了重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果表明該酶的熱穩(wěn)定性較差,在30℃以下比較穩(wěn)定,溫度高于30℃時,酶活力下降較快；重組蛋白具有較廣的pH范圍,在pH5～9.5之間較穩(wěn)定。在23℃和pH7.5處呈現(xiàn)出最佳的活性,比活性為1.3 U／mg。在所測試金屬離子和抑制劑中,金屬離子Zn2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+和PMSF抑制劑對酶活具有強烈的抑制作用,所以該酶在處理和保存的過程中盡量避免與

7、這些影響因子的接觸。
　　 綜上所述,本研究成功構(gòu)建了克隆載體pMD-lysB和表達載體pET22b-lysB,重組質(zhì)粒pET22b—lysB轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后獲得了較高產(chǎn)量的重組蛋白His—LysB。獲得的His—LysB呈現(xiàn)出較高的脂肪酶活性,具有較寬泛的pH范圍,但熱穩(wěn)定差且對多種金屬離子和抑制劑敏感。本試驗的研究結(jié)果不僅為今后研究分支桿菌噬菌體裂解酶基因簇之間及其與宿主菌之間的相互作用機制奠定了基礎(chǔ),