VEGF-A165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP-25質(zhì)粒的NSC34細(xì)胞的ALS細(xì)胞模型的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、背景:肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退行性病變，主要表現(xiàn)為肌無(wú)力、肌萎縮、癱瘓。發(fā)病年齡一般在35-50歲之間，生存期3-5年，迄今尚無(wú)有效的治療方法，目前利魯唑是市場(chǎng)上唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)對(duì)ALS治療有效的藥物，但只能平均延長(zhǎng)患者生存期2-3月。大約90-95％為散發(fā)型，5-10％為家族型。在家族型ALS中，突變的超氧化物歧化酶-1(SOD-1)基因是發(fā)病

2、的主要原因。另外，編碼突變蛋白TDP-43的TARDBP基因以及編碼突變型RNA結(jié)合蛋白的FUS基因，都是與家族型ALS發(fā)病相關(guān)的基因。TDP43是由TARDBP基因中的6個(gè)外顯子編碼，TDP-43蛋白由414個(gè)氨基酸組成，由2個(gè)RNA識(shí)別序列和1個(gè)富含甘氨酸的C末端組成，具有DNA以及RNA結(jié)合蛋白的能力。同時(shí)，TDP-43可在富含甘氨酸的末端被截?cái)?，形成兩個(gè)C末端的片段，分別為25KD、35KD，TDP25、TDP35都具有細(xì)胞毒性

3、，其中TDP25的細(xì)胞毒性是其中最強(qiáng)的。
　　雖然ALS的發(fā)病機(jī)制并不十分明確，但是研究表明與線粒體的損傷、谷氨酸興奮性毒性、免疫系統(tǒng)的破壞、異常蛋白聚集等有關(guān)。此外，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)不足也是重要原因。各種生長(zhǎng)因子包括VEGF、IGF-1等在ALS中的表達(dá)是不同的，但它們都有巨大的神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)ALS中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的增殖。VEGF是血管源性的生長(zhǎng)因子，它對(duì)各種細(xì)胞都有高效的促進(jìn)分裂能力以及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞避免腦損害的能力，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)

4、胞的生長(zhǎng)和調(diào)控有著重要的作用，而且對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)、神經(jīng)元的遷移有著直接的作用。最近的研究表明，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞處于低氧、低糖、氧化應(yīng)激等不利條件時(shí)，VEGF可作為調(diào)節(jié)者調(diào)控各種復(fù)雜的機(jī)制，避免神經(jīng)元死亡和刺激神經(jīng)生長(zhǎng)。
　　VEGF家族可分為7種亞型，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PLGF、VEGF-E、svVEGF。VEGF-A是由33-42kDa組成的二聚體糖蛋白。它的基因的表達(dá)受許多條件的影響，包括低氧、

5、生長(zhǎng)因子、NO、p53突變、甲狀腺生長(zhǎng)激素、腫瘤生長(zhǎng)因子。VEGF-A的高表達(dá)信使RNA主要存在于腎上腺、肝臟、心臟、腦。VEGF-A由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，根據(jù)其活性的不同又分為多種亞型，其中VEGF165是活性最強(qiáng)的。研究表明，在過(guò)表達(dá)VEGF-A的SOD-1 G93A轉(zhuǎn)基因ALS小鼠與單純的SOD-1 G93A轉(zhuǎn)基因ALS小鼠相比，其神經(jīng)元的死亡減少、疾病的發(fā)病時(shí)間延遲、生存率增加。目前尚無(wú)VEGF-A165在穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25

6、的NSC34細(xì)胞的ALS細(xì)胞模型中治療效果的研究報(bào)道。
　　目的:研究VEGF-A165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞的ALS細(xì)胞模型的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討VEGF-A165發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法:首先采用流式細(xì)胞儀篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞，將穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP-25質(zhì)粒的NSC34細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)而通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中TDP25蛋白的表達(dá)水平，證明選用的細(xì)胞是穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC3

7、4細(xì)胞以建立ALS的細(xì)胞模型。然后用不同濃度的VEGF-A165處理穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞，采用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力，確定VEGF-A165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞的最適藥物濃度。用最適藥物濃度的VEGF-A165干預(yù)細(xì)胞，測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量觀察VEGF-A165對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞的保護(hù)作用。最后，采用免疫印跡法檢測(cè)在凋亡通路上caspase3蛋白水平的變化，及在氧化應(yīng)激通

8、路上HO-1蛋白水平的變化，以研究VEGF-A165的作用通路。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)western blot法檢測(cè)流式細(xì)胞儀篩選后細(xì)胞中TDP25蛋白，結(jié)果顯示細(xì)胞中有TDP25蛋白的表達(dá)，表明選用的細(xì)胞是穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞，成功建立ALS的細(xì)胞模型。
　　2、觀察不同濃度的VEGF-A165處理穩(wěn)轉(zhuǎn)TDP25的NSC34細(xì)胞后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài)，CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)VEGF

9、-A165濃度達(dá)到5ng/ml時(shí)，細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞突起展開，細(xì)胞形態(tài)最好，細(xì)胞活力最高，因此篩選出VEGF-A165的最適藥物濃度為5ng/ml。
　　3、用最適藥物濃度的VEGF-A165干預(yù)細(xì)胞，LDH、MDA的檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥組與對(duì)照組比較給藥組LDH水平、MDA水平均明顯下降(P＜0.05)。
　　4、western blot法檢測(cè)caspase3、HO-1蛋白水平的變化，結(jié)果顯示給藥組與對(duì)照組比較，caspase