布拉氏酵母菌對(duì)NAFLD小鼠肝臟脂肪變及腸道菌群變化的初步研究.pdf

1、目的：
　　1.建立非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的動(dòng)物模型；
　　2.予布拉氏酵母菌散劑灌胃進(jìn)行干預(yù)，觀察肝臟組織病理學(xué)、生化指標(biāo)、蛋白表達(dá)、免疫學(xué)及腸道菌群變化，初步探討布拉氏酵母菌對(duì)小鼠NAFLD的療效及作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.38只雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，自由攝食AIN93對(duì)照飼料7天后，隨機(jī)分為Control組及西

2、方飲食（Western diet,WD）組，Control組16只，WD組22只。分別給予對(duì)照飲食及西方飲食（高脂肪高糖飲食），造模時(shí)間33周。33周后從WD組中隨機(jī)抽取12只小鼠，分為布拉氏酵母菌灌胃組（TB,n=6）及灌胃對(duì)照組（TD,n=6），分別給予布拉氏酵母菌（5.98×108CFU/kg/day）及果糖（284mg/kg/day）+乳糖（19mg/kg/day）灌胃，每日1次，共灌胃6周，6周后處死小鼠。
　　2.定期

3、觀察小鼠的進(jìn)食、精神狀態(tài)及毛發(fā)光澤度等，每周稱量小鼠體重并記錄。
　　3.觀察各組小鼠肝臟外形變化，記錄肝重，計(jì)算并比較肝重指數(shù)。
　　4.應(yīng)用蘇木素-伊紅（Hematoxylin and eosin,HE）染色觀察肝組織病理學(xué)的改變。
　　5.檢測(cè)布拉氏酵母菌干預(yù)前后血清甘油三酯（Triglyceride,TG）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate aminotransferase,AST）及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（A

4、lanine aminotransferase,ALT）、白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）及內(nèi)毒素的變化情況。
　　6.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescent quantitation PCR,Real-time QPCR）方法檢測(cè)布拉氏酵母菌干預(yù)前后肝組織中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）mRNA、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Tra

5、nsforming growth factor-β,TGF-β）mRNA、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor,TNF-α）mRNA的表達(dá)情況。
　　7.提取肝、脾組織中的淋巴細(xì)胞行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，了解布拉氏酵母菌干預(yù)前后肝、脾組織中CD4+/CD8+比值、CD4+T細(xì)胞IL-17、RORγt的表達(dá)情況。
　　8.應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)布拉氏酵母菌干預(yù)前后肝臟組織中α-SMA及TNF-α的表達(dá)情況

6、。
　　9.應(yīng)用16s rRNA宏基因組測(cè)序的方法了解布拉氏酵母菌干預(yù)后小鼠腸道菌群的變化情況。
　　結(jié)果：
　　1.西方飲食喂養(yǎng)C57BL/6雄性小鼠33周后行肝臟HE染色：Control組肝臟肝細(xì)胞大小及排列正常，WD組可見(jiàn)彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，造模成功。灌胃后，與TD組比較，TB組肝臟脂肪變程度及炎癥程度減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.與Control組比較，WD組血清中A

7、LT、AST及TG均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同TD組比較，TB組血清中ALT、AST及TG均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　3. Real-time QPCR：與Control組比較，WD組TGF-β、TNF-α、α-SMA mRNA的表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TB組較TD組TNF-αmRNA表達(dá)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而TD組及TB組之間TGF-βmRNA、α-

8、SMA mRNA均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。
　　4.血清IL-17：與Control組比較，WD組IL-17表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與TD組比較，TB組IL-17的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　5.血清內(nèi)毒素：WD組內(nèi)毒素水平較Control組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與TD組比較，TB組內(nèi)毒素水平下降（P＜0.05）。
　　6.流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果示：肝臟：

9、與Control組比較，WD組CD4+/CD8+、CD4+T RORγt的表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD4+T IL-17表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05），同TD組比較，TB組CD4+/CD8+、CD4+T RORγt表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CD4+T IL-17的表達(dá)量未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）；脾臟：CD4+/CD8+、CD4+T RORγt、CD4+T IL-17表達(dá)量WD組與Cont

10、rol組之間，TB組與TD組之間均未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）。
　　7.免疫組化：α-SMA：與Control組比較，WD組α-SMA表達(dá)量增高（P＜0.05）；布拉氏酵母菌干預(yù)后，TB組及TD組未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）；TNF-α：與Control組比較，WD組表達(dá)量增高（P＜0.05），同TD組比較，TB組表達(dá)下降（P＜0.05）。
　　8.16s rRNA宏基因組測(cè)序：布拉氏酵母菌干預(yù)后TB組較TD組增多的有：厚

11、壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和放線菌門（Actinobacteria），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TB組較TD組減少的有:擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），含量較多的前15種菌群中其余菌群未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)采用經(jīng)典的西方飲食，成功建立了NAFLD小