三黃煎劑調(diào)節(jié)Aurora激酶A影響乳腺癌生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本研究擬探討三黃煎劑對(duì)Aurora激酶A(Aurora KinaseA，AURKA)的調(diào)節(jié)作用及三黃煎劑對(duì)乳腺癌生物學(xué)行為的影響，其中包括對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、遷移、侵襲、上皮細(xì)胞間質(zhì)化(Epithelial-to-Mesenchymal Transition, EMT)標(biāo)志物、血管新生的影響，并闡釋兩者之間的內(nèi)在聯(lián)系;同時(shí)初步探索三黃煎劑對(duì)內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬、化療藥物表柔比星作用于乳腺癌細(xì)胞藥效的影響。
　　方

2、法:
　　1.采用CCK-8法檢測(cè)三黃煎劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231增殖的影響。AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測(cè)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率。Western Blot法檢測(cè)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　2.qRT-PCR法檢測(cè)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞AURKA、p53的mRNA表達(dá)水平。Western Blot法檢測(cè)MCF-7、MDA-MB

3、-231細(xì)胞AURKA、p53蛋白的表達(dá)水平。siRNA沉默MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中AURKA，并用CCK-8法檢測(cè)AURKA敲減對(duì)三黃煎劑作用于MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制的影響。
　　3.運(yùn)用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三黃煎劑對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞粘附率的影響，Transwell小室法檢測(cè)三黃煎劑對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲的影響。WesternBlot法檢測(cè)三黃煎劑對(duì)M

4、CF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中EMT標(biāo)志物表達(dá)的影響。
　　4.在腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)條件下，運(yùn)用Transwell小室法檢測(cè)三黃煎劑及AURKA siRNA對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)遷移的影響，Matrigel基質(zhì)膠管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)三黃煎劑對(duì)HUVECs管腔形成能力的影響。分別運(yùn)用ELISA法及qRT-PCR法檢測(cè)三黃煎劑及AURKA

5、siRNA對(duì)乳腺癌細(xì)胞中VEGF分泌水平及轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　5.采用CCK-8法、AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測(cè)三黃煎劑聯(lián)合他莫昔芬對(duì)MCF-7細(xì)胞，及三黃煎劑聯(lián)合表柔比星對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率的影響。Western Blot法檢測(cè)三黃煎劑聯(lián)合他莫昔芬對(duì)MCF-7細(xì)胞，及三黃煎劑聯(lián)合表柔比星對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.

6、三黃煎劑對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率呈濃度梯度依賴增長（P＜0.05），給藥48小時(shí)療效好于24小時(shí)(P＜0.05)，與給藥72小時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。三黃煎劑能夠誘導(dǎo)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，并上調(diào)c-PARP、Bax蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　2.三黃煎劑能夠下調(diào)AURKA蛋白及mRNA的表達(dá)、上調(diào)p53蛋白及mRNA的表達(dá)。siRNA沉默AURKA后，三黃煎劑對(duì)M

7、CF-7細(xì)胞增殖抑制率下調(diào)了50.0％(49.2％降至24.8％)，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率下調(diào)了34.6％（51.5％降至33.7％）。
　　3.三黃煎劑能夠顯著降低乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的黏附率、遷移率、侵襲率(P＜0.01)。此外，與ARUKA敲減作用相似，三黃煎劑還能上調(diào)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中“上皮”標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)，下調(diào)“間質(zhì)”標(biāo)志物N-cadherin

8、、vimentin、snail、slug蛋白的表達(dá)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.與AURKA沉默作用類似，三黃煎劑能夠抑制在乳腺癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)下的HUVECs遷移、管腔形成(P＜0.01)，同時(shí)能夠抑制乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞VEGF分泌，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5.三黃煎劑與他莫昔芬聯(lián)用能夠增加他莫昔芬對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率，調(diào)節(jié)凋亡

9、相關(guān)蛋白c-PARP、Bcl-2、Bax水平，與表柔比星聯(lián)用同樣能夠增加表柔比星對(duì)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白c-PARP、Bcl-2、Bax水平，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　結(jié)論:本研究顯示，三黃煎劑能夠在mRNA水平及蛋白水平調(diào)節(jié)AURKA，并通過調(diào)節(jié)AURKA誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖;調(diào)節(jié)EMT標(biāo)志物表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲;下調(diào)VEGF轉(zhuǎn)錄水平抑制乳腺