乳腺癌生物學(xué)行為相關(guān)基因的臨床意義.pdf

1、前言：
　　乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女健康。盡管目前應(yīng)用的抗腫瘤綜合治療已經(jīng)很大提高了臨床療效，但這些治療仍不能有效的減少乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，及控制晚期乳腺癌的進(jìn)展，而復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌治療失敗和患者死亡的主要原因。近年來(lái)隨著腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展，腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源。乳腺癌干細(xì)胞作為異質(zhì)性的全體腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生源泉，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，侵襲轉(zhuǎn)移中起著極其重要的作用。從腫瘤干細(xì)胞的角度探討乳腺癌

2、發(fā)生發(fā)展和耐藥的機(jī)制和尋找治療策略的改進(jìn)有著事半功倍的效果。
　　材料與方法：
　　一、病例組織標(biāo)本
　　276乳腺癌標(biāo)本來(lái)源于2003年1月-2006年12月年間就診于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤外科和遼寧省腫瘤醫(yī)院并行乳腺癌根治手術(shù)治療的乳腺癌患者。均為女性患者，平均年齡45歲（25～76歲）。我們?nèi)〉昧嗣恳晃换颊叩臅?shū)面知情同意，實(shí)驗(yàn)通過(guò)了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。標(biāo)本滿足條件如下:
　　(a)患者經(jīng)過(guò)有

3、效手術(shù)治療;
　　(b)切除的乳腺癌組織經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢測(cè);
　　(c)手術(shù)后有至少15個(gè)淋巴結(jié)送病理確認(rèn);
　　(d)有完整的臨床病理資料，不符合上述條件的乳腺癌患者排除在外。
　　我們?nèi)〉昧嗣恳晃换颊叩臅?shū)面知情同意，實(shí)驗(yàn)通過(guò)了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
　　二、試劑
　　1)鼠源性單克隆抗人Oct4，Nanog抗體購(gòu)自美國(guó)Abicom公司，正常山羊血清封閉液購(gòu)自武漢博士德公司;
　　2）Ul

4、tra Sensitive TM S-P超敏濃縮試劑盒:Kit-0305，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;LI-9032/9033 DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。鼠源性單克隆抗人Nestin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，Nanog抗體購(gòu)自美國(guó)Abicom公司，正常山羊血清封閉液購(gòu)自武漢博士德公司;
　　3）Ultra Sensitive TM S-P超敏濃縮試劑盒:Kit-

5、0305，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;LI-9032/9033 DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
　　三、方法
　　組織中Nestin，Oct-4與Nanog蛋白的表達(dá)檢測(cè)應(yīng)用免疫組織化學(xué)(IHC)方法;CD44+/CD24-CSC分選采用免疫熒光抗體標(biāo)記后流式細(xì)胞儀二次分選，CSC培養(yǎng)采用低粘附培養(yǎng)板下的無(wú)血清懸浮培養(yǎng);細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine TM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行;TGF

6、-β處理細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)化(EMT);蛋白和mRNA表達(dá)檢測(cè)分別采用Western Blot和RT-PCR，細(xì)胞成瘤能力檢測(cè)采用C57BL/6SCID鼠成瘤試驗(yàn)，細(xì)胞侵襲力檢測(cè)采用Trans Well的方法檢測(cè)。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。Nestin，Oct-4與Nanog的表達(dá)與臨床病例參數(shù)的相關(guān)性采用Pearson卡方檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法進(jìn)行;總體生存期(Overa

7、ll survival,OS)及無(wú)病生存期(desease free survival，DFS)采用Kaplan-Meier方法計(jì)算，生存期組間比較采用log-rank檢驗(yàn);Cox regression模型單變量及多變量分析用于檢驗(yàn)影響生存主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素;P＜0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　結(jié)果：
　　126例乳腺癌標(biāo)本中Oct-4與Nanog的陽(yáng)性表達(dá)率分別為41.27％(52/126)，36.51％(47/126)，其

8、中26(20％)例患者Oct-4與Nanog表達(dá)均為陽(yáng)性。與陰性表達(dá)的患者相比，Oct-4(P=0.01)與Nanog(P=0.01)陽(yáng)性表達(dá)的患者OS均較差，而且Oct-4與Nanog共表達(dá)的患者預(yù)后最差(P=0.001 Vs Oct-4-/Nanog-)。COX回歸模型分析發(fā)現(xiàn)Oct-4是影響乳腺癌預(yù)后獨(dú)立的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.003)。我們進(jìn)一步檢測(cè)了Oct-4和Nanog共表達(dá)在維持乳腺癌干細(xì)胞EMT特性中的作用。我們發(fā)現(xiàn)沉默

9、Oct-4和Nanog后，CSC中N-cadherim，Vimentin，Slug，and Snail的表達(dá)顯著降低，E-cadherin和CK-18的表達(dá)顯著上調(diào)，相反，Oct-4和Nanog的過(guò)表達(dá)顯著的增加了N-cadherin，Vimentin，Slug，and Snail的表達(dá)，降低了E-cadherin和CK-18的表達(dá)。以上的這些改變?cè)谵D(zhuǎn)染后72小時(shí)更加明顯。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，在TGF-β處理后，N-cadherinbr

10、ight E-cadherin-表型的EMT-樣CSC的比例明顯升高。我們進(jìn)一步分離了TGF-β處理后N-cadherinbright E-cadherin-表型的EMT-樣和N-cadherindim E-cadherinbright非EMT樣CSC，比較了Oct-4和Nanog的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明Oct-4和Nanog mRNA水平在EMT-樣CSC細(xì)胞中較非-EMTCSC顯著升高(p＜0.05 for both)。我們進(jìn)一

11、步探測(cè)Oct-4 and Nanog的表達(dá)對(duì)于TGF-β誘導(dǎo)的CSC細(xì)胞EMT的重要性。CSC細(xì)胞同時(shí)沉默或同時(shí)過(guò)表達(dá)Oct-4和Naong，在轉(zhuǎn)染siRNA或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后24小時(shí)，細(xì)胞用TGF-β處理72小時(shí)，檢測(cè)N-cadherin，E-cadherin，CK-18，Vimentin，Slug，和Snail等的mRNA和蛋白表達(dá)水平。乳腺癌CSC中，Oct-4和Nanog同時(shí)沉默后，與未受刺激的細(xì)胞相比，TGF-β刺激導(dǎo)致細(xì)胞N-c

12、adherin，Snail的表達(dá)上調(diào)，E-cadherin和CK18表達(dá)水平下調(diào)，表明在Oct-4與Nanog共沉默的CSC中TGF-β仍可以誘導(dǎo)細(xì)胞EMT過(guò)程;有趣的是在Oct-4與Nanog共同高表達(dá)的CSC中，與未刺激的CSC細(xì)胞相比，TGF-β刺激后N-cadherin，Vimentin，Slug,和Snail的表到水平并未改變，但是E-cadherin和CK-18的表達(dá)水平輕微升高;這些結(jié)果表明乳腺癌CSC細(xì)胞中Oct-4和N

13、anog的表達(dá)對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程具有一定影響。表明Oct-4和Nanog高表達(dá)后細(xì)胞的侵襲力增加。我們采用免疫組化的方法檢測(cè)了150例三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中Nestin的表達(dá)，結(jié)果表明癌組織中有41例(27.33％)患者癌細(xì)胞胞漿內(nèi)可檢測(cè)到Nestin的表達(dá);進(jìn)一步研究表明三陰性乳腺癌患者中，Nestin陽(yáng)性表達(dá)的患者生存期較Nestin陰性的患者明顯縮短。我們探討了Nestin對(duì)乳腺癌干細(xì)胞致瘤性的影響，結(jié)果表明Nest

14、in+的乳腺癌干細(xì)胞致瘤性較Nestin-的乳腺癌干細(xì)胞強(qiáng)。較強(qiáng)的腫瘤形成能力往往與細(xì)胞的增殖力有關(guān)，于是我們進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了Nestin沉默后乳腺癌干細(xì)胞周期和凋亡的變化，與對(duì)照組相比Nestin沉默的乳腺癌干細(xì)胞G2/M期的細(xì)胞比例顯著增加，伴有死亡細(xì)胞比例的增加;同時(shí)Nestin沉默后凋亡細(xì)胞的比率較對(duì)照組明顯增加(43.53±4.78％vs.16.24±3.22％，p＜0.01)。因此，Nestin沉默后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期

15、阻滯于G2/M，及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果迸一步證明Nestin促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞的增殖及存活。為闡明Nestin影響乳腺癌干細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制我們采用Western blot的方法檢測(cè)了Nestin沉默后乳腺癌干細(xì)胞中EMT相關(guān)基因及調(diào)控基因的表達(dá)，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比Nestin沉默后N-cadherin，Vimentin和α-SMA表達(dá)顯著下調(diào)，E-cadherin明顯增加;并且MMP2，MMP9及VEGF的表達(dá)也明顯下降;這些結(jié)果

16、表明Nestin沉默后抑制了乳腺癌干細(xì)胞自發(fā)EMT過(guò)程，其機(jī)制可能與迷亂性的激活Wnt/β-catenin通路有關(guān)。最后我們通過(guò)western blot的方法檢測(cè)了Nestin沉默后是如何影響GSK-3β的磷酸化水平，Nestin可能通過(guò)間接促進(jìn)乳腺癌干細(xì)胞中GSK-3β的磷酸化進(jìn)而提高Wnt/β-catenin通路活性。
　　結(jié)論：
　　Oct-4的表達(dá)與乳腺癌起源和生物學(xué)行為的關(guān)系已成為腫瘤研究過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題。通過(guò)

17、本研究提示Oct-4在乳腺癌中高表達(dá)，不但與乳腺癌的生物學(xué)行為密切相關(guān)，而且是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。同時(shí)，TGF-β/Sma3與Oct-4/Nanog在促進(jìn)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同作用。
　　Nestin在一些三陰性乳腺癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)并與患者的不良預(yù)后有關(guān)，而且，我們發(fā)現(xiàn)Nestin陽(yáng)性的乳腺癌干細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外克隆增殖能力及對(duì)裸鼠較強(qiáng)的致瘤性，敲除Nestin表達(dá)后抑制乳腺癌干細(xì)胞的增殖和侵襲力，誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡;敲除