癌基因DEK對結(jié)直腸癌生物學行為的影響及其臨床意義.pdf

1、研究背景：結(jié)直腸癌是消化道最常見惡性腫瘤之一，根治術后5年生存率約65％。已知增殖和轉(zhuǎn)移是其主要的致死原因，因此，明確結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機制、尋找能夠有效評估患者預后的分子標志物是延長結(jié)直腸癌患者生存期的關鍵。
　　癌基因DEK是一個新發(fā)現(xiàn)的DNA拓撲結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)因子，位于染色體6p22.3，為高度保守的可磷酸化的核蛋白，由位于核常染色質(zhì)的375個氨基酸組成，優(yōu)先表達于增殖活躍的惡性細胞，在每個核內(nèi)可以達到400到600萬拷貝量，是一

2、種可以影響細胞分裂、DNA修復、抑制細胞分化、老化和凋亡以及轉(zhuǎn)化的致癌基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，癌基因DEK在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要的促癌作用，可以作為乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的增殖檢測指標及治療靶點，但在結(jié)腸癌中的作用機制尚不清楚。
　　研究目的：本研究通過細胞學實驗研究癌基因DEK對結(jié)直腸癌細胞生物學行為的影響，初步探討DEK基因參與結(jié)腸癌演進的分子機制；進而通過組織學實驗驗證DEK基因?qū)Y(jié)直腸癌預后評估的臨床價值，為結(jié)直腸癌提供有效

3、的預后評估指標及治療靶點。
　　材料和方法：
　　1.細胞學實驗部分：通過RT-PCR和Western blotting方法檢測DE K在不同結(jié)腸癌細胞系HCT116、HT29、SW480和SW620中的表達，并通過免疫熒光對siControl-和siDEK-SW620細胞進行染色，在共聚焦顯微鏡下觀察DEK蛋白在SW620細胞中的定位。經(jīng)siDEK轉(zhuǎn)染SW620細胞后，進行MTT、細胞分子克隆等功能實驗檢測DEK沉默后細胞

4、增殖能力的變化；利用Hoechst33342細胞核染色及流式細胞術檢測DEK基因沉默后細胞凋亡水平的變化；再通過劃痕實驗檢測DEK沉默后SW620細胞遷移能力的影響；通過Western blot方法檢測DEK沉默對SW620細胞中增殖、凋亡及遷移相關因子的變化；
　　2.組織學實驗部分：利用RT-PCR和Western blot方法檢測術后4例新鮮結(jié)直腸癌及其癌旁組織中DEK基因mRNA和蛋白水平的表達；免疫組化方法對109例術后

5、結(jié)直腸癌組織及其癌旁組織、52例結(jié)直腸腺瘤組織蠟塊進行DEK蛋白的檢測，比較DEK蛋白表達與患者臨床病理學特征的相關性，并通過生存分析驗證DEK蛋白表達對臨床患者預后評估的價值。
　　結(jié)果：
　　1.細胞學實驗部分：RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，結(jié)直腸細胞株HCT116、HT29、SW480和SW620中均有DEK mRNA和蛋白的表達；免疫熒光染色表明DE K基因主要表達于SW620細胞核；MTT及細胞克

6、隆實驗顯示當DEK基因沉默后（siDEK濃度為100nM），SW620細胞的增殖能力明顯下降；Hoechst33342染色顯示DEK基因沉默后（siDEK濃度為100nM），凋亡細胞數(shù)量明顯增加，同時通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)siDEK主要促進細胞的早期凋亡；劃痕實驗表明siDEK（100nM）轉(zhuǎn)染后SW620細胞的遷移能力明顯下降；最后Western blot檢測結(jié)果顯示，DEK會上調(diào)mutant-p53、MDM2和PARP的表達和Bcl

7、-2/Bax的比率、抑制caspase-3和caspase-9的活性，并通過抑制E-cadherin及β-catenin的活性而增加其轉(zhuǎn)移侵襲能力；
　　2.組織學實驗部分：新鮮結(jié)直腸癌組織RT-PCR和Western blot實驗顯示，DEK的mRNA和蛋白水平均明顯高于正常組織；免疫組化結(jié)果表明，DEK蛋白在結(jié)直腸癌中的陽性率（97.2%）和強陽性率（48.6%）也均明顯高于周圍正常結(jié)直腸粘膜組織（陽性率33.0%，強陽性率9

8、.2%）及良性腺瘤組織（陽性率32.7%，強陽性率13.5%），并與患者腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤以及分期等臨床病理學特點密切相關；生存分析發(fā)現(xiàn)，DEK高表達患者的無瘤生存率及5年生存率均低于DEK低表達者；DEK表達聯(lián)合淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜侵潤、病理分期和CEA水平共同影響總生存率；DEK蛋白高表達是結(jié)直腸癌預后不良的獨立風險因子。
　　結(jié)論：DEK高表達于結(jié)腸癌的細胞及組織中；DEK促進結(jié)腸癌細胞的增殖、平板克隆形成