結(jié)直腸癌ADMR-CRLR干擾抑制癌惡性生物學(xué)行為實驗研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率位于惡性腫瘤的第三位，死亡率居于惡性腫瘤致死原因的第五位。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因遺傳學(xué)和微環(huán)境改變的累積過程。K-ras基因點突變在結(jié)直腸癌發(fā)生率近45％，該部分患者對傳統(tǒng)化療藥物耐受增加，表皮生長因子受體抑制劑等靶向分子治療亦往往失效。另外，結(jié)腸腫瘤生長速度超過新生血管形成時，局部微環(huán)境就表現(xiàn)為低氧狀態(tài)。低氧微環(huán)境(＜2％O2)是結(jié)直腸癌的重要生長特性之一，它不僅使腫瘤細(xì)胞對

2、化療耐藥增加，還促進腫瘤血管生成和侵襲性。為了系統(tǒng)性探討K-ras突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞在“低氧”微環(huán)境下的細(xì)胞適應(yīng)模式，我們前期通過cDNA微陣列芯片分析篩選到ADM是低氧下K-ras突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞的關(guān)鍵下游基因，發(fā)現(xiàn)ADM在K-ras突變型結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并促進結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲。
　　ADM是Kitamura等從人的嗜鉻細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)并分離出來的一種血管活性肽，生理狀態(tài)下，ADM可以通過與受體結(jié)合，增加cAMP水平，促進血

3、管生成，影響血管張力和通透性，同時已有許多研究表明其與腫瘤血管生成密切相關(guān)。ADM作為一種血管活性肽，它需要通過與受體的結(jié)合才能起作用，可以與它結(jié)合的受體主要包括兩種，即ADM特異性受體（ADMR）和降鈣素受體樣受體(CRLR)。本研究將通過檢測結(jié)直腸癌組織及癌細(xì)胞株中ADM、ADMR及CRLR的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征之間的相關(guān)性，從而明確ADM及其受體在結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為中的作用;通過RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建特異性ADMR及C

4、RLR shRNA重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入結(jié)腸癌細(xì)胞，觀察結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為（細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移）的變化;并采用基因芯片表達(dá)譜技術(shù)篩選ADMR和CRLR潛在的下游互作基因并進行初步驗證。
　　具體研究內(nèi)容包括四部分:
　　1.ADM、ADMR及CRLR在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與結(jié)直腸癌病理特征之間的相關(guān)性
　　①qPCR檢測26對結(jié)直腸癌及正常組織，20對結(jié)直腸癌旁組織中ADM、ADMR及CRLR mRNA表達(dá)水平

5、;
　?、诮Y(jié)合臨床資料分析ADM、ADMR及CRLR表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床各病理參數(shù)之間的關(guān)系;
　?、跼T-PCR和Western blot檢測7種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中ADMR及CRLR的表達(dá)。
　　2.ADMR及CRLR shRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和驗證
　?、賟PCR和Western Blot驗證能有效抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞ADMR和CRLR表達(dá)的siRNA序列;
　　②根據(jù)驗證的siRNA序列構(gòu)建重

6、組shRNA質(zhì)粒，包裝LV-ADMR shRNA和LV-CRLR shRNA，并轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HT-29，RT-PCR和Western Blot分別測定兩株細(xì)胞中ADMR及CRLR mRNA和蛋白的表達(dá)水平，證實干擾成效。
　　3.特異性ADMR及CRLR干擾后結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HT-29惡性生物學(xué)行為的變化
　?、俨捎肕TS實驗觀察ADMR及CRLR干擾對RKO和HT-29細(xì)胞增殖的影響;
　?、诓捎昧?/p>

7、式細(xì)胞儀檢測ADMR及CRLR干擾對RKO細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響;
　?、跿ranswell實驗研究ADMR及CRLR對結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響。
　　4.ADMR及CRLR潛在的下游互作基因的初步篩選及驗證
　　在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADMR及CRLR shRNA的RKO細(xì)胞中利用Metastasis基因PCR陣列分析篩選出與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游互作基因;對其中6個候選互作基因分別在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ADMR及CRLR shRNA

8、的RKO和HT-29細(xì)胞中進行qPCR驗證。
　　所得研究結(jié)果如下:
　　1.ADM、ADMR及CRLR在結(jié)直腸癌中高表達(dá)
　?、俳Y(jié)直腸癌組織中的ADM及CRLR mRNA水平均較配對正常組織顯著上調(diào)(0.0986±0.0799/0.0660±0.0708,p=0.0181;0.121±0.0175/0.0064±0.0089, p=0.0083,n=26)，ADMR mRNA水平雖較配對正常組織上調(diào)，但差異并無統(tǒng)計學(xué)

9、意義（0.0034±0.0039/0.0031±0.0034，p=0.4548，n=26）。結(jié)直腸癌癌旁組織中的CRLRmRNA水平較配對正常組織顯著上調(diào)(0.0069±0.0086/0.0037±0.0041，p=0.0146，n=20)，ADM mRNA水平也較配對正常組織上調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.0935±0.0751/0.0742±0.0771，p=0.0821，n=20），ADMR mRNA水平與配對正常組織的差異無統(tǒng)計學(xué)

10、意義（0.0035±0.0032/0.0038±0.0036，p=0.4429，n=20）;
　　②在兩組有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中，ADM、ADMR及CRLR mRNA的表達(dá)均有統(tǒng)計學(xué)差異(p=0.0000/0.0261/0.0092)。在20例癌旁組織中，8例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNMⅢ期）與12例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNMⅠ和Ⅱ期）比較，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的癌旁組織中，ADM、ADMR及CRLR mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào)(p=0.00

11、05/0.0225/0.0318)。6例低分化癌與20例高-中分化癌比較，在低分化癌患者的結(jié)直腸癌組織中CRLR mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)(p=0.0156)。結(jié)直腸癌和癌旁組織中ADM、ADMR及CRLR mRNA表達(dá)水平與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、浸潤深度和五年生存狀況無明顯相關(guān)性(p＞0.05);
　?、跘DMR mRNA的表達(dá)在SW620、RKO、HT29、DLD-1及LOVO等結(jié)直腸癌細(xì)胞株中相對較高;CRLR

12、mRNA的表達(dá)在SW480、SW620、RKO、HT29、DLD-1及HCT116中相對較高;ADMR蛋白表達(dá)在RKO和LOVO細(xì)胞株中水平較高;CRLR蛋白表達(dá)在HT29和HCT116細(xì)胞株中水平較高。篩選出RKO和HT-29二株腸癌細(xì)胞作為綜合高表達(dá)的細(xì)胞株。
　　2.ADMR及CRLR shRNA重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和驗證
　　①qPCR檢測siRNA對ADMR及CRLR的干擾效應(yīng)，ADMR下調(diào)68.8％，CRLR

13、下調(diào)了97.3％，Western Blot檢測結(jié)果與其一致，證明干擾靶點有效;
　?、诜€(wěn)定轉(zhuǎn)染了LV-ADMR shRNA和LV-CRLR shRNA的RKO和HT-29二株細(xì)胞出現(xiàn)了ADMR及CRLR基因干擾，即ADMR和CRLR mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　3.干擾ADMR及CRLR表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌的生長和侵襲
　?、貯DMR shRNA和CRLR shRNA均能抑制RKO和HT-29細(xì)胞的增殖，聯(lián)合ADM

14、R+CRLR shRNA的作用更為顯著(p＜0.01);
　　②聯(lián)合干擾ADMR及CRLR可致RKO細(xì)胞早期凋亡和總凋亡增加(13.16％/5.03％;22.73％/9.26％);單純干擾CRLR和聯(lián)合干擾ADMR及CRLR可致HT-29細(xì)胞早期凋亡和總凋亡增加(20.48％，22.43％/13.79％;24.57％，27.13％/16.35％);
　?、弁庠葱栽黾覣DM50nmol/L和200nmol/L后，可以明顯促進R

15、KO和HT-29細(xì)胞的遷移，通過Transwell小室的貼壁細(xì)胞對照實驗，RKO細(xì)胞:30.333±4.353，22.600±2.558/13.067±2.374; HT-29細(xì)胞:31.533±3.662，20.2±5.308/13.000±2.478（p均＜0.01）。給予ADM200nmol/L未見較ADM50nmol/L對細(xì)胞的促遷移能力增加;
　?、芟鄬τ趯φ战M，無論單純干擾ADMR或CRLR，還是聯(lián)合干擾ADMR和CR

16、LR，Transwell細(xì)胞遷移對照實驗結(jié)果均顯示RKO細(xì)胞遷移顯著抑制(10.8±2.5，9.9±1.8，5.8±2.0/17.1±2.9，p均＜0.01)，尤其以聯(lián)合干擾組的作用最為顯著。在對轉(zhuǎn)染了空載的細(xì)胞重新添加外源性ADM50nmol/L后，重見RKO細(xì)胞的遷移增加(從17.1±2.9至37.3±4.9)，但是在ADMR、CRLR已下調(diào)后再外源性增加ADM，對細(xì)胞遷移增加的能力受限。同樣在HT-29細(xì)胞遷移實驗中也觀察到了一致

17、的結(jié)果。表明ADM對結(jié)腸癌細(xì)胞促遷移能力依賴于特異性受體;
　?、軹ranswell細(xì)胞侵襲試驗結(jié)果顯示，相對于對照組，特異性干擾RKO細(xì)胞，無論單純或聯(lián)合干擾ADMR和CRLR，都可以顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲（12.6±1.4，11.8±1.8，6.9±2.0/17.1±1.2，p均＜0.01），在轉(zhuǎn)染了空載的細(xì)胞中再外源性添加ADM50nmol/L后，可以促進細(xì)胞的侵襲(從17.1±1.2至29.3±2.6)，在ADMR、CRLR

18、特異性下調(diào)后再外源性增加ADM，促進細(xì)胞侵襲的能力明顯受限。在HT-29細(xì)胞侵襲實驗中也觀察到了一致的結(jié)果，說明ADM對結(jié)腸癌細(xì)胞促侵襲能力依賴于特異性受體。
　　4.ADMR及CRLR分別調(diào)控多個與轉(zhuǎn)移相關(guān)的下游互作基因
　　篩選到ADMR的下游互作基因上調(diào)8個;CRLR的下游互作基因上調(diào)4個、下調(diào)1個。這些基因主要參與細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。qPCR證實其中的APC、EGF、PIK3CA、PIK3CB

19、和DVL1的mRNA水平明顯升高，而NOS2的mRNA水平顯著下降，與其在基因表達(dá)譜芯片中的結(jié)果相符。
　　綜上述得出研究結(jié)論如下:
　　1.ADM與ADMR、CRLR在人結(jié)直腸癌組織表達(dá)增高，并與結(jié)直腸癌分化、分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性行為的臨床病理特征有關(guān)。結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO和HT-29具有特征性代表。
　　2.成功地將特異性構(gòu)建的慢病毒ADMR shRNA和CRLR shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和