腫瘤壞死因子α誘導血管內皮細胞中BACE1水解ST6GAL-1調節(jié)VE-Cadherin的唾液酸化與功能.pdf

1、單核細胞侵襲血管內皮層進入人內膜最終形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變形成早期事件之一。該過程涉及多種糖蛋白參與，但其機制尚不清楚。本項目以血管內皮細胞為研究對象，以α2,6-唾液酸轉移酶1（ST6GAL1）是否通過催化 VE-Cadherin唾液酸化發(fā)揮其在細胞間緊密連接的作用，而BACE1蛋白降解途徑對ST6Gal-1可能起調控作用為研究核心，探討細胞粘聯(lián)的分子機制，尋找炎癥誘發(fā)動脈粥樣硬化的分子基礎。通過建立 BACE1基因過表達轉染

2、模型，采用western blot、SNA/MAA blot、免疫共沉淀技術、流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡等技術,檢測 TNF-α誘導前后細胞中唾液酸化和粘附功能的差異，及對PKC信號級聯(lián)系統(tǒng)的影響。以期回答糖基轉移酶是如何影響動脈硬化形成這一科學問題，為相關疾病的防治提供新的思路。本研究分為三個部分：
　　第一部分：炎癥損傷模型的建立。
　　目的：以內皮細胞EA.hy926及RAEC細胞為研究對象，建立炎癥損傷內皮細胞模型

3、，采用分子生物學的技術手段，分析不同內皮細胞在炎癥因子的作用下內皮細胞超顯微結構和單核-內皮粘附功能的變化，為實驗模型建立奠定基礎。
　　方法：⑴采用免疫熒光的方法，驗證EA.hy926細胞和RAEC細胞是否具有內皮細胞特性。⑵采用CCK8法，驗證TNF-α對內皮細胞活力的影響。⑶采用倒置顯微鏡，觀察TNF-α對內皮細胞的影響。⑷采用細胞粘附實驗，驗證TNF-α對單核-內皮粘附功能的影響。⑸采用透射電鏡，觀察TNF-α對內皮細胞超

4、顯微結構的影響。
　　結果：①形態(tài)學結果表明，EA.hy926細胞和RAEC細胞具有內皮細胞特異性。②CCK8實驗及倒置顯微鏡結果顯示，TNF-α濃度在0-50ng/ml時，時間在0-24h時，不會顯著地抑制EA.hy926細胞存活率。TNF-α濃度在0-20ng/ml時，時間在0-24h時，不會顯著地抑制RAEC細胞存活率。③粘附實驗結果證實，TNF-α在0-50ng/ml范圍內，能誘導EA.hy926細胞與THP-1細胞的粘附

5、能力顯著上升；TNF-α在0-20ng/ml范圍內，能誘導RAEC細胞與THP-1細胞的粘附能力顯著上升。④電鏡結果表明，與對照組相比，TNF-α能破壞EA.hy926細胞的緊密連接。
　　結論：⑴EA.hy926細胞和RAEC細胞具有內皮細胞特異性。⑵炎癥因子刺激下，單核-內皮細胞粘附功能上調。⑶炎癥因子刺激后，影響內皮細胞之間的緊密連接。
　　第二部分：TNF-α通過上調BACE1表達，誘導內皮細胞中VE-Cadheri

6、n唾液酸下調，從而破壞內皮細胞的緊密連接及上調單核-內皮的粘附能力。
　　目的：探討在炎癥條件下 BACE1的上調是否通過降解 ST6GAL1影響VE-Cadherin唾液酸化修飾。分析BACE1水解 ST6GAL1對內皮細胞緊密連接和單核-內皮粘附功能的影響。
　　方法：⑴采用流式細胞術，驗證TNF-α對內皮細胞唾液酸化的影響。⑵采用western blot和激光共聚焦顯微鏡，驗證炎癥時 BACE1水解ST6GAL1下調內

7、皮細胞的唾液酸化。⑶采用免疫共沉淀技術，驗證VE-cadherin時炎癥誘導內皮細胞唾液酸化下調的靶蛋白。⑷采用BACE1抑制劑（β-secretase inhibitor IV），驗證BACE1抑制劑對炎癥條件下BACE1水解ST6GAL1對內皮細胞唾液酸化的影響及對單核-內皮細胞粘附功能和內皮細胞超顯微結構的影響。⑸構建BACE1過表達模型，驗證BACE1水解ST6GAL1調控內皮細胞唾液酸化的相關機制，并檢測其對單核-內皮粘附功能

8、和內皮細胞超顯微結構的影響。
　　結果：①TNF-α刺激24h后，與對照組相比，F(xiàn)ITC-SNA標記的平均熒光強度值顯著下調，說明TNF-α誘導了EA.hy926和RAEC細胞的α2,6-唾液酸水平下調。而FITC-MAL標記的平均熒光強度值未見統(tǒng)計學意義的變化，說明TNF-α不能顯著改變RAEC細胞的α2,3-唾液酸水平。②Western blot結果顯示，與對照組比較，TNF-α誘導BACE1蛋白表達水平上調，同時ST6GAL

9、1及總蛋白α2,6-唾液酸水平的表達水平下調。免疫熒光實驗表明，正常的內皮細胞的表面存在α2,6-唾液酸修飾，而TNF-α誘導后，內皮細胞的α2,6-唾液酸修飾水平降低。③IP實驗顯示，與對照組相比，TNF-α誘導后 VE-Cadherin的唾液酸化水平顯著降低。④Western blot和免疫熒光實驗表明，BACE1抑制劑能拮抗TNF-α誘導的BACE1上調及BACE1降解ST6GAL1及下調內皮細胞的唾液酸化。細胞粘附實驗顯示，BA

10、CE1抑制劑能拮抗TNF-α誘導的單核-內皮粘附能力的升高。透射電鏡結果顯示，BACE1抑制劑能拮抗 TNF-α破壞內皮細胞之間的緊密連接。⑤過表達BACE1基因后，Western blot和免疫熒光實驗表明，ST6GAL1和內皮細胞唾液酸化的表達下調。細胞粘附實驗顯示，過表達BACE1基因后，單核-內皮的粘附能力升高。透射電鏡結果顯示，過表達BACE1破壞內皮細胞之間的緊密連接。
　　結論：⑴TNF-α誘導內皮細胞唾液酸水平的下

11、調。⑵TNF-α誘導BACE1降解 ST6GAL1下調VE-Cadherin的唾液酸化，從而提高單核-內皮細胞的粘附功能及破壞內皮細胞的緊密連接。⑶BACE1抑制劑通過拮抗BACE1水解ST6GAL1的相關機制，從而影響單核-內皮的粘附能力及內皮細胞的緊密連接。⑷BACE1基因過表達后，BACE1水解 ST6GAL1，通過下調靶蛋白VE-Cadherin的唾液酸化降低了內皮細胞的唾液酸化，從而影響單核-內皮的粘附能力及內皮細胞的緊密連接

12、。
　　第三部分：TNF-α上調BACE1表達的相關機制。
　　目的：探討TNF-α通過PKC/MEK/ERK信號通路上調BACE1的表達。
　　方法：⑴采用western blot，驗證TNF-α通過激活PKC的磷酸化上調BACE1的表達。⑵采用western blot，驗證PKC/MEK/ERK信號級聯(lián)系統(tǒng)之間的關系，并驗證TNF-α通過激活PKC/MEK/ERK信號級聯(lián)系統(tǒng)上調BACE1的表達。⑶采用粘附實驗，驗

13、證炎癥條件下 PKC信號通路對單核-內皮粘附功能的影響。
　　結果：①與對照組相比，PKC的磷酸化水平顯著升高。②與對照組相比，PKC的激活劑上調了BACE1的表達(P<0.05)，PKC的抑制劑拮抗了BACE1的上調(P<0.05)。③與TNF-α組相比，PKC抑制劑組的MEK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，ERK抑制劑組的MEK磷酸化水平沒有顯著的變化(P＞0.05)（。圖3.3A、B）與TNF-α組相比，PKC抑制劑組的

14、ERK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，ERK抑制劑組的ERK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。（圖3.3C、D）與TNF-α相比，PKC的抑制劑或ERK的抑制處理后，BACE1的表達水平顯著下調(P＜0.05)。這一結果表明 TNF-α通過激活PKC/MEK/ERK信號級聯(lián)系統(tǒng)上調BACE1的表達。④與 TNF-α組相比，PMA處理后單核-內皮的粘附能力顯著升高(P＜0.05)。PKC的抑制劑處理后單核-內皮的粘附能力顯著降低(P