人類蛋白磷酸酶基因PP2Cκ和類固醇脫氫酶基因HSDL2的功能研究.pdf

1、本論文分兩個(gè)部分，分別研究了作為細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)基因的PP20c和作為化學(xué)小分子代謝相關(guān)基因的HSDL2的初步生物學(xué)功能。 蛋白質(zhì)的磷酸化／去磷酸化作用是調(diào)節(jié)真核細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的一種重要方式，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控等許多過(guò)程中都起到至關(guān)重要的作用。我們從人胎腦cDNA文庫(kù)中克隆到一個(gè)新的蛋白磷酸酶基因，PP2Cκ，其cDNA全長(zhǎng)2034bp，編碼一個(gè)372個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，該蛋白具有一個(gè)完整的蛋白磷酸酶2C催化結(jié)構(gòu)域，屬

2、于絲蘇氨酸磷酸酶中的PP2C亞家族。PP2Cκ基因定位于人染色體4q21-22，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成。逆轉(zhuǎn)錄PCR顯示，該基因廣泛的表達(dá)于所有我們檢測(cè)的正常成人和胎兒組織，在成人腦、卵巢、心臟、胰腺、腎組織和胎兒心臟、胸腺等組織表達(dá)量相對(duì)較高。原核表達(dá)的PP2Cκ蛋白對(duì)磷酸化的蘇氨酸多肽具有去酸磷化的絲蘇氨酸磷酸酶活性。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PP2Cκ蛋白集中定位于細(xì)胞核內(nèi)。PP2Cκ過(guò)量表達(dá)能夠顯著激活細(xì)胞內(nèi)的熱休克轉(zhuǎn)錄

3、因子通路。我們通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PP2Cκ對(duì)熱休克轉(zhuǎn)錄因子通路的激活，很可能是通過(guò)直接與熱休克轉(zhuǎn)錄因子相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，PP2Cκ和熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)在細(xì)胞核內(nèi)呈共定位分布，體外相互作用實(shí)驗(yàn)證明二者有一定的結(jié)合能力。這為研究細(xì)胞熱休克調(diào)控通路提供了一個(gè)新的研究方向。我們還利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選可能與PP2Cκ有相互作用的蛋白，研究這些候選蛋白與PP2C~c是否真的存在有相互作用，能夠進(jìn)一步揭示PP2Cκ這個(gè)廣譜表達(dá)的絲蘇氨酸

4、磷酸酶在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能。 類固醇脫氫酶參與體內(nèi)固醇類物質(zhì)代謝的反應(yīng)，對(duì)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)與發(fā)育起到了極為重要的作用。通過(guò)對(duì)人胎腦cDNA文庫(kù)的大規(guī)模的序列分析，我們克隆到一條類似類固醇脫氫酶的cDNA，命名為HSDL2。該cDNA全長(zhǎng)3211bp，編碼一個(gè)418氨基酸的多肽。該蛋白包含了一個(gè)短鏈脫氫酶催化結(jié)構(gòu)域以及一個(gè)固醇載體蛋白家族的SCP-2結(jié)構(gòu)域，而且包含有短鏈脫氫酶家族典型的NAD(P)+輔酶結(jié)合位點(diǎn)(TGxxxGxG

5、)及酶活性位點(diǎn)(S-Y-K)等保守基序。蛋白質(zhì)序列分析表明HSDL2蛋白與小鼠及果蠅中的同源蛋白具有較高的相似性。該基因定位于人9號(hào)染色體長(zhǎng)臂的32區(qū)，包含了n個(gè)外顯子。逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果則顯示該蛋白在人主要組織中廣泛表達(dá)，尤其在肝、腎、前列腺、睪丸和卵巢中表達(dá)量很高。原核表達(dá)的HSDL2融合蛋白具有與輔酶NADPH結(jié)合的能力。細(xì)胞內(nèi)綠熒光定位實(shí)驗(yàn)顯示，該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞中過(guò)表達(dá)含有SCP2結(jié)構(gòu)域膽固醇的HSDL2，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞總膽固